HPLC法測定蘭考泡桐花中洋芹素和熊果酸的含量

牛江龍， 趙建波， 陳佳銘， 吳德峰， 方 波， 盧艷花*， 韓海龍， 孟 華

(1.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海200237;2.上海朝翔生物技術有限公司，上海201611)

泡桐屬(Paulownia)植物是玄參科(Scrophulariace)落葉喬木，原產于我國，現有9個種，4個變種［1］。蘭考泡桐(Paulownia elongata S.Y.Hu)是其中重要的一種，分布在中國大陸的山東、河南、江蘇、陜西、安徽、湖北等地，生長于海拔800米的地區。蘭考泡桐常生長在野外，目前尚未由人工引種栽培。泡桐不僅是材質優良的樹種，且其花、葉、果、樹皮、根均可入藥。近年來研究發現泡桐植物具有抗氧化［2］、抗菌［3］、抗病毒［4］等藥理活性。

泡桐花中主要含有三萜、倍半萜、黃酮、β-谷甾醇等多種化學成分［5，6］，其中以黃酮和三萜酸類物質含量最為豐富。前期研究工作發現，洋芹素和熊果酸是蘭考泡桐花中的主要活性成分。由于其顯著藥理活性，泡桐花資源已引起人們廣泛的關注。但有關蘭考泡桐花中洋芹素和熊果酸含量的測定方法尚未見報道。本文采用高效液相色譜法測定蘭考泡桐花的中洋芹素和熊果酸的含量，為蘭考泡桐花資源的進一步開發和利用提供了科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀系列(脫氣機G1322A、四元泵G1311A、自動進樣機G1313A、柱恒溫箱G1316A和二極管陣列檢測器DAD G1315B);超聲波清洗器SCQ25-1(上海聲浦超聲波設備廠);自動雙重純水蒸餾器1810B(上海申立玻璃儀器有限公司)。

1.2 材料

洋芹素和熊果酸對照品均是由本課題組從蘭考泡桐花中分離得到，含量≥98%，其FAB-MS、IR、1H NMR、13C NMR 數據與文獻報道的一致［7-9］。泡桐花由上海朝翔生物技術有限公司提供，經華東理工大學盧艷花教授鑒定為蘭考泡桐花。甲醇為色譜純(Caledon Laboratories LTD.Georgetown，Ont.，canada)，水為二次重蒸餾水。

2 蘭考泡桐花中洋芹素的含量測定

2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:甲醇-水(45∶55);流速:1.0 mL/min;檢測波長:340 nm;柱溫:24℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取洋芹素對照品，加甲醇配制成濃度為0.22 mg/mL的對照品溶液，4℃保存。

2.2.2 供試品溶液的制備 蘭考泡桐花60℃干燥并粉碎后過20目篩，精密稱取5.0 g粉末，置于100 mL量瓶中，加75%乙醇80 mL，超聲提取60 min，放置至室溫，定容至刻度，搖勻。取1.0 mL溶液，10 000 r/min離心15 min，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 標準曲線及線性范圍

分別精密吸取對照品貯備溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得各濃度分別為 11.0，22.0，33.0，44.0，55.0 μg/mL對照品溶液。各對照品溶液進樣20 μL，以對照品的含量(μg)為橫坐標，峰面積平均值為縱坐標，繪制標準曲線。線性回歸方程為Y=4 518.5X－40.77，R2=0.999 9(n=5)。測試結果表明，洋芹素的進樣量在0.22～1.10 μg范圍內具有良好的線性關系。

2.4 精密度試驗

取上述洋芹素對照品溶液，重復進樣5次，測定其峰面積平均值為2 935.5，RSD=0.27%。測定結果表明精密度良好。

2.5 重復性試驗

取同一批蘭考泡桐花粉末樣品5份，按照2.2.2項方法制備供試樣品溶液，測其峰面積，RSD=1.82%。測定結果表明重復性良好。

2.6 穩定性試驗

取上述洋芹素對照品溶液，分別于0，2，4，8，12 h測定其峰面積，RSD=0.81% 。測定結果表明其在12 h內穩定性較好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的蘭考泡桐花粉末樣品1.0 g，共5份，分別精密加入洋芹素對照品溶液2.5 mL(0.22 mg/mL)，按照2.2.2項方法制備供試樣品溶液。處理后，按照2.1項色譜條件測定分析，計算回收率。結果見表1。

表1 洋芹素加樣回收率試驗

2.8 樣品測定

精密吸取洋芹素對照品溶液、供試品溶液各10 μL，按照2.1項色譜條件測定分析，計算樣品中洋芹素的含量，結果見表3，色譜圖見圖1。

圖1 洋芹素對照品與供試樣品HPLC圖譜

3 蘭考泡桐花中熊果酸的含量測定

3.1 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:甲醇-水(90 ∶10);流速:1.0 mL/min;檢測波長:210 nm;柱溫:24℃。

3.2 溶液配制

3.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取熊果酸對照品，加甲醇配制成濃度為0.52 mg/mL的對照品溶液，4℃保存。

3.2.2 供試品溶液的制備 見2.2.2項。

3.3 標準曲線及線性范圍

分別精密吸取對照品貯備溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得各濃度分別為 104.0，208.0，312.0，416.0，520.0 μg/mL對照品溶液。各對照品溶液進樣20 μL，以峰面積平均值為縱坐標，對照品的含量(μg)為橫坐標，繪制標準曲線。線性回歸方程為Y=201.83X+77.87，R2=0.998 3。測試結果表明，熊果酸的進樣量在2.08～10.40 μg范圍內具有良好的線性關系。

3.4 精密度試驗

取上述熊果酸對照品溶液，重復進樣5次，測定其峰面積平均值為1 345.8，RSD=0.42%。測定結果表明精密度良好。

3.5 重復性試驗

取同一批蘭考泡桐花粉末樣品5份，按照2.2.2項方法制備供試樣品溶液，測其峰面積，RSD=1.71%。測定結果表明重復性良好。

3.6 穩定性試驗

取上述熊果酸對照品溶液，分別于0，2，4，8，12 h測定其峰面積，RSD=0.66%。測定結果表明其在12 h內穩定性較好。

3.7 加樣回收率試驗

取已知含量的蘭考泡桐花粉末樣品5份，精密加入熊果酸對照品溶液2.0 mL(0.52 mg/mL)，按照2.2.2項方法制備供試樣品溶液。處理后，按照2.1項色譜條件測定分析，計算回收率。結果見表2。

表2 熊果酸加樣回收率試驗

3.8 樣品測定

精密吸取熊果酸對照品溶液、供試品溶液各10 μL，按照2.1項色譜條件測定分析，計算樣品中熊果酸的含量，結果見表3，色譜圖見圖2。

表3 蘭考泡桐花中洋芹素與熊果酸的含量測定結果(n=5)

圖2 熊果酸對照品與供試樣品HPLC圖譜

4 討論

取洋芹素和熊果酸對照品溶液，在200～400 nm掃描紫外吸收光譜，根據光譜顯示，分別選擇340 nm和210 nm作為其檢測波長，這樣既可以避免流動相對基線的影響，又提高檢測的靈敏度。

本實驗建立的HPLC方法測定不同溶劑的蘭考泡桐花提取物中洋芹素和熊果酸的含量，該方法簡便、快速、重現性好，分離效果好，數據準確可靠，為相關植物中洋芹素和熊果酸含量的測定提供了科學的分析手段，同時，為蘭考泡桐花開發利用的進一步產業化奠定了技術基礎。

［1］中國林業科學研究院泡桐組.泡桐研究［M］.(第1版).北京:農業出版社，1980，7:7-22.

［2］Smejkal K，Graycova L，Mark R，et al.C-geranyl compounds from Paulounia tomentosa fruits［J］.J Nat Prod，2007，70(8):1244-1248.

［3］Smejkal K，Chudik S，Kloucek P，et al.Antibacterial C-geranyl flavonoids from Paulownia tomentosa fruits ［J］.J Nat Prod，2008，71(4):706-709.

［4］Kang K H，Huh H，Kim B K，et al.An antiviral furanoquinone from Paulownia tomentosa Steud ［J］.Phytother Res，1999，13(7):624-626.

［5］段文達，張 堅，謝 剛，等.白花泡桐花的化學成分研究［J］. 中藥材，2007，30(2):168-170.

［6］Chen Juan，Liu Yong，Shi Yanping.Determination of flavonoids in the flowers of Paulownia tomentosa by high-performance liquid chromatography［J］.J Anal Chem，2009，64(3):282-288.

［7］中國科學院上海藥物研究所植物化學研究室編譯.黃酮體化合物鑒定手冊［M］.北京:北京科學出版社，1981.

［8］Pant P，Rastogi RP.Castanopsone and Castanopsol Two New Triterpenoids from Castanopsis indica［J］.Phytochemistry，1977，16(11):1787-1789.

［9］Seo S，Tomita Y，Tori K.Carbon-13 NMR spectra of urs-12-ens and application to structural assignments of components of Isodon japonicus Hara tissue cultures［J］.Tetrahedron Lett，1975，1:7-10.