斷血流皂苷A血漿濃度的自動(dòng)柱切換高效液相色譜法測(cè)定

陳嬌婷， 詹怡飛， 王躍生

(1.贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西贛州341000;2.湖州營(yíng)養(yǎng)與健康產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新中心，浙江 湖州313000;3.國(guó)家中藥固體制劑工程中心，江西南昌330000)

斷血流皂苷A(clinopodiside A)為中藥斷血流的主要成分，具有止血功效［1］，屬于齊墩果烷型三萜皂苷類(lèi)，含量較高，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

柱切換技術(shù)采用切換閥連接2根或2根以上相同或不同分離機(jī)理的色譜柱，通過(guò)改變流動(dòng)相走向，在前一根色譜柱完成被測(cè)組份與干擾雜質(zhì)的分離，達(dá)到純化與富集的目的，在隨后的色譜柱完成被測(cè)組份的測(cè)定。因此，該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品的直接進(jìn)樣分析，基本克服了以往樣品前處理復(fù)雜、繁瑣且耗費(fèi)試劑、人工等缺點(diǎn)，使得該技術(shù)在分析含量低、干擾大、檢測(cè)困難的復(fù)雜樣品時(shí)顯示出巨大的優(yōu)越性。同時(shí)，該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)柱前、柱后、痕量富集及制備等操作，并易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作［2，3，4］。本實(shí)驗(yàn)建立斷血流皂苷A血漿濃度的柱切換高效液相色譜測(cè)定方法。為今后闡明斷血流皂苷A的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為、新藥研發(fā)以及相關(guān)制劑研究提供指導(dǎo)和依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

Agilent公司1100系列高效液相色譜儀(包括DAD檢測(cè)器);FCV-2A高壓切換閥;高速離心機(jī)(上海安寧科學(xué)儀器公司);BSZ-2型自動(dòng)雙重水蒸餾系統(tǒng)(上海博通);SartoriusBP221S型電子天平(美國(guó)Sartorius公司);TG328B型析天平(萬(wàn)分之一天平)(上海天平儀器廠)。

斷血流皂苷A對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，甲醇為色譜純，水為三重蒸餾水(自制)，其余試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 預(yù)處理柱(簡(jiǎn)稱(chēng)PC):大連裝Kromasil C18(20 mm ×4 mm，5 μm);預(yù)處理流動(dòng)相(簡(jiǎn)稱(chēng) PMP):甲醇-水;預(yù)處理流動(dòng)相流速:1.0 mL/min;分析柱(簡(jiǎn)稱(chēng)AC):Lichrospher 100 RP-18e(250 mm ×4 mm，5 μm);分析流動(dòng)相(簡(jiǎn)稱(chēng) AMP):甲醇-0.01 mol/mL磷酸鹽緩沖液(磷酸調(diào)pH=3.0)(60∶40);分析流動(dòng)相流速:0.6 mL/min;分析柱柱溫:45℃;檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm。

2.1 色譜行為 樣品的CSHPLC分析圖譜見(jiàn)圖1，斷血流皂苷A保留時(shí)間約為7 min，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)干擾較小，樣品峰形良好。

物業(yè)管理公司部門(mén)錯(cuò)綜復(fù)雜，對(duì)于成本的管理上比較困難，往往需要建立完善的管理機(jī)制，同時(shí)對(duì)工作中的細(xì)節(jié)也不能忽視。具體來(lái)說(shuō)，造成物業(yè)管理公司成本的來(lái)源多，管理困難，這就要求對(duì)公司的成本管理設(shè)計(jì)要從根本上進(jìn)行，除了對(duì)制度和政策上成本的控制外，還要對(duì)物業(yè)管理過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)節(jié)成本進(jìn)行具體研究，改進(jìn)細(xì)節(jié)成本管理的不足，把微小工作中產(chǎn)生的成本降到最低。

2.5 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 取一定量(高、中、低3種濃度)斷血流皂苷A對(duì)照品大鼠血漿樣品，分別進(jìn)行樣品處理液穩(wěn)定性試驗(yàn):進(jìn)樣條件下樣品處理液在5℃放置0、4、10、20、40 h進(jìn)樣分析;樣品冷凍放置穩(wěn)定性試驗(yàn):-20℃冷凍儲(chǔ)藏，分別放置0、6、20、40 d后按1.2.3項(xiàng)下樣品處理步驟處理進(jìn)樣分析;室溫放置穩(wěn)定性試驗(yàn):室溫放置0、1、2、4 h后按1.2.3項(xiàng)下樣品處理步驟處理進(jìn)樣分析。所用測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度均在89～112%范圍內(nèi)，RSD均＜5%，斷血流皂苷A在上述條件下均穩(wěn)定性良好。

2.3 日內(nèi)和日間精密度 取一定量(高、中、低3種濃度)斷血流皂苷A對(duì)照品大鼠血漿液，按1.2.3項(xiàng)下樣品處理步驟處理，采用斷血流皂苷A血漿柱切換高效液相色譜法測(cè)定，在1 d內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次，得日內(nèi)精密度 RSD分別為1.22%，0.81%和0.39%(n=6);連續(xù)3 d測(cè)定，測(cè)得各濃度的日間精密度RSD分別為:1.67%、0.74%和0.45%(n=6)。

1.2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取干燥至恒重的斷血流皂苷A對(duì)照品7.5 mg，置25 mL量瓶中，用分析流動(dòng)相溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得含斷血流皂苷A為0.3 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果

圖論問(wèn)題在18世紀(jì)初期就已經(jīng)開(kāi)始有運(yùn)用，由于現(xiàn)代計(jì)算機(jī)的出現(xiàn)，圖論的應(yīng)用則越來(lái)越廣泛，包括結(jié)構(gòu)化學(xué)、計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)以及數(shù)學(xué)競(jìng)賽等。使用圖論可以提供給我們一個(gè)快速解決問(wèn)題的方式和角度。數(shù)學(xué)題中應(yīng)用題相對(duì)偏多，而應(yīng)用題往往都是在實(shí)際背景下產(chǎn)生出來(lái)的題型，在數(shù)學(xué)競(jìng)賽中是一種相對(duì)比較重要且難度較大的題型，主要考查學(xué)生如何通過(guò)數(shù)學(xué)相關(guān)的知識(shí)來(lái)解決和分析實(shí)際問(wèn)題的能力，而這個(gè)能力則是通過(guò)解決數(shù)學(xué)圖論的能力來(lái)展現(xiàn)。

結(jié)果表明斷血流皂苷A在15～45 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2 線(xiàn)性關(guān)系 取空白大鼠血清1 mL，加入上述對(duì)照品溶液 0.5，0.7，0.9，1.1，1.3，1.5 mL，置于 10 mL 棕色量瓶中，加甲醇至刻度，得到濃度為 0.015，0.021，0.027，0.033，0.039，0.045 mg/mL的系列對(duì)照品溶液。按照1.2.3項(xiàng)下樣品處理步驟制備成對(duì)照品溶液，在擬定色譜條件下精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量(x，μg)對(duì)峰面積進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得方程為:Y=0.3113x-0.0441(r=0.999 5)。

高中電磁學(xué)反映的是電場(chǎng)與磁場(chǎng)的相互作用關(guān)系，揭示的是物理宏觀世界的本質(zhì)規(guī)律，抽象的概念與規(guī)律缺乏表象基礎(chǔ)，注重外部表面特征和非本質(zhì)聯(lián)系的高中學(xué)生對(duì)于可見(jiàn)度不高的電磁現(xiàn)象及電磁規(guī)律顯得很茫然。只有認(rèn)識(shí)公式、理解公式，準(zhǔn)確應(yīng)用公式表述問(wèn)題，才能避免亂套公式、混淆公式的現(xiàn)象。

圖1 斷血流皂苷A的CSHPLC圖譜

1.2.4 柱切換系統(tǒng)及操作 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用自裝定時(shí)裝置，控制切換閥自動(dòng)切換。該裝置可預(yù)置T1(樣品預(yù)處理時(shí)間)和T2(AC與PC串聯(lián)時(shí)間)。樣品進(jìn)樣的同時(shí)啟動(dòng)該裝置，首先使切換閥處于PC與AC并聯(lián)的A(預(yù)處理)狀態(tài)，經(jīng)T1(2 min)時(shí)間的預(yù)處理后切換閥自動(dòng)切換至PC與AC串聯(lián)的B狀態(tài)，使保留在PC上的樣品組分被AMP洗脫至AC上，經(jīng)T2(2 min)時(shí)間后，即自動(dòng)切回初始A狀態(tài);待下次進(jìn)樣時(shí)再次啟動(dòng)該裝置重復(fù)操作。

金-白云石階段：形成自然金-方鉛礦-黃銅礦、輝銀礦等礦物組合，為金的次要成礦階段，方鉛礦、黃銅礦、輝銀礦主要在這個(gè)階段富集。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取斷血流皂苷A對(duì)照品大鼠血漿液，按1.2.3項(xiàng)下樣品處理步驟處理制備6份對(duì)照品溶液，采用斷血流皂苷A血漿柱切換高效液相色譜法測(cè)定，得RSD為2.1%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

馬克思主義哲學(xué)關(guān)于內(nèi)容和形式相互作用的描述中，認(rèn)為內(nèi)容是決定形式的，內(nèi)容必須要有與之相適應(yīng)的形式，同時(shí)，形式也是反作用于內(nèi)容的，是能夠促進(jìn)或者阻礙內(nèi)容發(fā)展的。因此，在思想文化融入基層生產(chǎn)的過(guò)程中，載體的作用是萬(wàn)萬(wàn)不可小看的，它為枯燥、抽象的思想文化工作注入了生命的活力，找到了思想文化在生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)工作中的切入點(diǎn)。

4月21日，袁世凱發(fā)布臨時(shí)大總統(tǒng)令：“現(xiàn)在國(guó)務(wù)院業(yè)經(jīng)成立，在京原有各部事務(wù)，應(yīng)即分別交替。由各部總長(zhǎng)接收辦理。”在臨時(shí)大總統(tǒng)的命令下，前清部院立即停止辦公，準(zhǔn)備辦理交接手續(xù)。

1.2.3 樣品處理步驟 取大鼠血漿樣品1.0 mL，置2 mL具塞離心試管中，加0.3 mol/L的三氯乙酸0.2 mL，離心(4 000 r/min，10 min)，精密量取上清液置于試管中，氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?5%甲醇溶液轉(zhuǎn)入1 mL量瓶中，加15%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.6 凈化回收率 取一定量(高、中、低3種濃度)斷血流皂苷A對(duì)照品血漿液，按前述色譜條件測(cè)定含量5次，另取相同進(jìn)樣量斷血流皂苷A對(duì)照品溶液，直接進(jìn)樣測(cè)定。按峰面積計(jì)算，得血漿凈化回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 凈化回收率結(jié)果(n=5)

2.7 方法回收率 于空白大鼠血漿中加入一定量(高、中、低3種濃度)斷血流皂苷A對(duì)照溶液，按1.2.3項(xiàng)下樣品處理步驟處理，按前述色譜條件測(cè)定含量5次，求出回收量濃度(即實(shí)測(cè)值)與加入量濃度之比，即為斷血流皂苷A血漿空白加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 方法回收率結(jié)果(n=5)

3 討論

3.1 預(yù)處理柱選擇與作用

實(shí)驗(yàn)初期曾用保護(hù)預(yù)柱(8 mm×4.0 mm)作預(yù)處理柱，雖基本能達(dá)到預(yù)期效果，但峰形很快變寬，影響測(cè)定的穩(wěn)定性，然后采用20 mm短分析柱作預(yù)處理柱，保留時(shí)間恒定，峰形好，壽命長(zhǎng)。

3.2 切換時(shí)間選擇

切換時(shí)間窗越窄，則進(jìn)入分析柱的雜質(zhì)越少，但由于預(yù)處理柱未置恒溫箱內(nèi)，室溫變化，流動(dòng)相放置或新配后對(duì)保留時(shí)間均有一定影響，選擇時(shí)間窗較寬一些，雖然前面雜質(zhì)峰多一點(diǎn)，但不影響測(cè)定。

綜上所述，本法具有操作簡(jiǎn)便，靈敏準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用于斷血流皂苷A血藥濃度測(cè)定、藥代動(dòng)力學(xué)以及生物利用度的研究。

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