萎胃寧濃縮丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

鄧 沂， 魏舒暢， 李 蕓*， 苗小樓， 金 輝

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州730050;3.安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，安徽蕪湖241000)

萎胃寧濃縮丸由黃連、黃芩、芍藥、白芷、木香、甘草、山楂等十二味中藥組成。萎胃寧方出自中國百年百名中醫(yī)名家于己百教授，以半夏瀉心湯為主，旋覆代赭湯為輔組得萎胃寧方。該方經(jīng)過大量的臨床實(shí)驗(yàn)證明對慢性萎縮性胃炎具有良好的療效。前期工作已對萎胃寧蜜丸進(jìn)行劑型改造，制成濃縮丸。目前，該制劑的質(zhì)量控制尚無定性鑒別指標(biāo)，僅有在前期工作中初步建立的芍藥苷含量測定方法［1］，且沒有對方中的君藥進(jìn)行質(zhì)量控制。為了控制該制劑的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用TLC建立了方中君藥黃連、臣藥甘草、佐藥白芍、白芷和使藥山楂的鑒別方法，并采用HPLC法建立君藥黃連的含量測定方法，為該制劑的質(zhì)量控制提供簡單、快速、可靠的實(shí)驗(yàn)方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀，600泵，2487雙波長吸光度檢測器，Empower色譜工作站;電子天平(BP211 Sartorious);ZFTC三用紫外分析儀(上海康華生化儀器有限公司);KQ-250型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);超純水制備儀(成都唐氏康科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥 對照品:鹽酸小檗堿(110713-200609，供含量測定用，含量 98.1%)、芍藥苷(110736-200629)、甘草苷(111610-200604)、歐前胡素(110826-200511，供鑒別用)、異歐前胡素(110827-200407，供鑒別用)、熊果酸(110742-200415，供鑒別用)和對照藥材:黃連(120913-200407)、甘草(120904-200511)、山楂(121138-200704)均購自中國藥品生物制品檢定所;試劑均為分析純，超純水自制。萎胃寧濃縮丸自制。各陰性樣品:按處方分別配成相應(yīng)的缺味處方藥，模擬制劑工藝制備。硅膠G，硅膠GF254薄層板(青島海洋化工廠)。

2 定性分析

2.1 黃連薄層色譜 分別取3批本品粉末1.0 g，加入20 mL甲醇回流15 min，過濾，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液。取黃連對照藥材20 mg及陰性對照粉末同法制備對照藥材溶液及陰性對照溶液，另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述4種溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水(6∶3 ∶1.5 ∶1.5 ∶0.5)為展開劑，置氨飽和的層析缸內(nèi)展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中在與對照藥材相應(yīng)的位置上顯相同的4個黃色熒光斑點(diǎn)，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的一個黃色熒光斑點(diǎn)，而陰性對照液無對應(yīng)斑點(diǎn)，見圖1。

2.2 山楂薄層色譜［2］分別取3批本品粉末3.0 g，加乙酸乙酯10 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液濃縮至3 mL，作為供試品溶液。取陰性對照粉末同法制備陰性對照溶液，另取熊果酸對照品1 mg，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液和陰性對照溶液各3 μL，熊果酸對照品2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸(32∶4∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10% 硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的一個紫紅色斑點(diǎn)，而陰性對照液無對應(yīng)斑點(diǎn)，見圖2。

圖1 黃連的TLC

圖2 山楂的TLC

2.3 白芷薄層色譜［2］分別取3批本品粉末5.0 g，加乙醚30 mL，回流30 min，放冷，過濾，回收乙醚，殘?jiān)右宜嵋阴? mL溶解，作為供試品溶液。同法制備陰性對照溶液。另取歐前胡素和異歐前胡素對照品，加乙酸乙酯分別制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述4種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(30～60℃)-乙醚(3∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，分別置紫外光燈254 nm和365 nm下檢視.供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的淡藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，而陰性對照液無對應(yīng)斑點(diǎn)，見圖3、4。

圖3 白芷的TLC(UV 254 nm)

圖4 白芷的TLC(UV 365 nm)

2.4 白芍、甘草的薄層鑒別［2-4］分別取3批本品粉末5.0 g，加乙醚50mL，回流1h，放冷，過濾，棄去乙醚液，藥渣揮干乙醚后加甲醇40 mL繼續(xù)回流1 h，放冷，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇萃取3次(每次20 mL)，合并正丁醇液，用水洗滌3次(每次20 mL)，將正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL作為供試品溶液。取甘草對照藥材1 g、甘草陰性對照樣品以及白芍陰性對照粉末同法制備甘草對照藥材溶液、甘草陰性及白芍陰性對照溶液，另取甘草苷、芍藥苷對照品，加甲醇分別制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述6種溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液(8∶1∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10% 硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品與對照藥材、對照品在相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對照無對應(yīng)斑點(diǎn)，見圖5。

圖5 甘草、白芍的TLC

3 定量分析

3.1 色譜條件 色譜柱:Theromo BDS Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈－0.1%磷酸(每100 mL含十二烷基磺酸鈉0.1 g，含三乙胺0.2 mL)(40∶60)(pH 6.0);流速:1.0mL/min;檢測波長:350 nm，進(jìn)樣量:20 μL，柱溫:30℃。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品貯備液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的鹽酸小檗堿對照品2.91 mg置于25 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻即可。

3.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末1.0 g(過80目篩)，精密稱取，置于100 mL量瓶中，加1%鹽酸的甲醇溶液70 mL，超聲(250 W，50 kHz)提取40 min，放至室溫，用流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液即得。

3.2.3 陰性對照品溶液的制備 取缺黃連的陰性對照樣品粉末，同供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

3.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液，在上述色譜條件下，各進(jìn)樣20 μL，測得HPLC圖譜(見圖6)，tR=14.645，分離度R=2.50，理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿計(jì)算不低于10 000。表明陰性樣品在與對照品色譜相同位置處無干擾。

圖6 對照品及樣品的HPLC色譜圖

3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對照品貯備液0.1、0.5、1、2、4、8 mL，分別置于 10 mL 量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，連同對照品貯備液共7份系列工作溶液，分別吸取20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積(Y)對濃度(X)進(jìn)行線性回歸，鹽酸小檗堿在1.142 μg/mL～114.2 μg/mL線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=8.28×107X－1.52×104，r=0.999 978(n=7)。

3.5 精密度試驗(yàn) 取同一對照品溶液依法重復(fù)進(jìn)樣5次，測得峰面積的RSD=0.96%。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在24 h內(nèi)每隔0.5 h、1 h 或不定的時間段(0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、18、24 h)進(jìn)樣 20 μL，測定峰面積并計(jì)算鹽酸小檗堿的 RSD=2.24%，可見，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品各5份，按供試品溶液的制備方法制備溶液，按上述色譜條件測得鹽酸小檗堿的平均含量為1.349 4 mg/g，RSD=2.79%。

3.8 最低檢測限 精密吸取上述對照品溶液適量，加流動相逐步稀釋至色譜圖中鹽酸小檗堿峰高為噪音的3倍(信噪比S/N≥3)。鹽酸小檗堿的最低檢測限為0.23 μg/mL。

3.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量(1.349 4 mg/g)的萎胃寧樣品各0.1 g，分別精密加入鹽酸小檗堿對照品溶液(0.114 2 mg/mL)1 mL，照供試品溶液制備方法制備并依法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.10 含量測定 精密稱取5批不同批號的萎胃寧樣品，按供試品溶液的制備方法制備溶液，測定含量，結(jié)果見表2

表2 含量測定結(jié)果

4 討論

4.1 黃連為方中君藥，對其進(jìn)行定性、定量分析具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用TLC對其進(jìn)行定性鑒別、采用HPLC對其有效成分鹽酸小檗堿進(jìn)行含量測定，所建方法操作簡便、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

4.2 山楂的鑒別曾調(diào)整展開系統(tǒng):苯-乙酸乙酯-甲酸比例(20∶4∶0.5)→(20∶6∶0.5)→(20∶10∶0.5)→(24∶4∶0.5)→(28∶4∶0.5)→(32∶4∶0.5)，以硅膠 G 薄層板展開，結(jié)果以后者效果最理想。

4.3 甘草、白芍的鑒別實(shí)驗(yàn)中，采用一種方法鑒別兩味中藥材，方法靈敏，陰性無干擾。

4.4 流動相的選擇:在含量測定時，流動相分別采用:A乙腈-磷酸系統(tǒng);B 乙腈-磷酸二氫鈉溶液系統(tǒng)［5-9］;C 乙腈-磷酸-硫酸鈉系統(tǒng)［2，10］;D 乙腈-磷酸-硫酸鈉-三乙胺系統(tǒng)［11-12］。采用A、B系統(tǒng)，樣品根本不能分離，形成一個或兩個肩峰或饅頭峰。考慮到鹽酸小檗堿為季銨鹽這一特殊性質(zhì)，在一般的固定相中不保留，為此考慮在流動相中加入離子對試劑十二烷基磺酸鈉(SDS)(即C系統(tǒng))，延長了被測組份在固定相中的保留時間，且色譜圖由一個或二個饅頭峰變?yōu)樵S多尖銳峰，基本上能看到被測組分的峰，但被測組分嚴(yán)重拖尾，并且達(dá)不到基線分離。通過分析流動相的pH值，試向流動相中加入了三乙胺(即D系統(tǒng))，結(jié)果分離效果很理想(見圖6B)，達(dá)到了基線分離，峰型對稱，不再拖尾，分離度為2.5，理論板數(shù)達(dá)到了160 00。

4.5 檢測波長的選擇:檢測波長曾選擇265 nm，270 nm，345 nm，350 nm，結(jié)果以350nm干擾峰最少，分離最好，效果最佳。

4.6 提取溶劑及時間的選擇:參照相關(guān)文獻(xiàn)［7-8］，對提取溶劑進(jìn)行了篩選。分別用甲醇、1%鹽酸的甲醇溶液進(jìn)行超聲提取，考察不同溶劑對鹽酸小檗堿含量的影響。結(jié)果采用1%鹽酸的甲醇溶液提取時，鹽酸小檗堿的含量比用甲醇提取的高。因此本試驗(yàn)選用1%鹽酸的甲醇溶液作為該制劑的提取溶劑;另外，通過試驗(yàn)摸索，比較不同超聲處理時間20、30、40、50、60 min 對提取效果的影響，結(jié)果在 40 ～60 min內(nèi)含量變化已不大，說明鹽酸小檗堿基本提盡，故選40 min為提取時間。

［1］鄧 沂，魏舒暢，金 輝.高效液相色譜法測定于氏萎胃寧濃縮丸中芍藥苷的含量［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22(6):1023-1024.

［2］中國藥典［S］.一部.2005，213;22;69;59.

［3］丁麗霞，常新全.中藥活性成分分析手冊(上)［M］.北京:學(xué)苑出版社，2007:2025;457;138.

［4］李 蕓，苗小樓，封士蘭，等.中藥濃縮丸大活絡(luò)丸中七味藥材的鑒別［J］.中成藥，2004，27(12)∶附2-5.

［5］王曉林，鐘方麗.HPLC測定復(fù)腎寧片中鹽酸小檗堿的含量［J］. 中成藥，2008，30(3):463-464.

［6］李中文，蔡紹松，魏 紅，等.桂林西瓜霜噴劑中鹽酸小檗堿快速含量測定方法的研究［J］.藥物分析，2009，29(4):659-662.

［7］劉 敏，陳明江，趙 海.HPLC測定風(fēng)痛安膠囊中鹽酸小檗堿的含量［J］. 中成藥，2008，30(3):461-463.

［8］吳 櫻，潘紅娟.HPLC測定三黃止癢搽劑中鹽酸藥根堿和鹽酸小檗堿的含量［J］.中成藥，2009，31(5):805-806.

［9］蔣瑩瑩，陳開鳳.高效液相色譜法測定芩黃喉癥膠囊中鹽酸小檗堿含量的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19(4):967-968.

［10］王 梅，吳 凌，王林鳳，等.HPLC測定大解毒顆粒中鹽酸小檗堿的含量［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，32(2):64-65.

［11］張蓓蕾，夏醒醒，陳勤.HPLC測定二妙丸中鹽酸小檗堿的含量［J］. 中成藥，2008，30(1):152-154.

［12］左金梁，李 丹，趙春杰，等.RP-HPLC法同時測定胃痛平糖漿中血根堿和小檗堿的含量［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2008，25(4):301-303.