抗淋病LTB-PorB核酸疫苗與蛋白疫苗聯合應用增強免疫應答的研究①

戴志兵 胡四海 劉清南 陳 敏 王玉峰 張愉快 余敏君 朱翠明 李忠玉 陸春雪

（南華大學病原生物學研究所,衡陽 421001）

抗淋病LTB-PorB核酸疫苗與蛋白疫苗聯合應用增強免疫應答的研究①

戴志兵 胡四海 劉清南②陳 敏 王玉峰 張愉快 余敏君 朱翠明 李忠玉 陸春雪

（南華大學病原生物學研究所,衡陽 421001）

目的:初步探討抗淋病LTB-PorB核酸疫苗與蛋白疫苗聯合免疫的免疫增強效應,為研制抗淋病疫苗提供實驗依據。方法:大量制備核酸疫苗（pcDNA3.1（-）/ltB-porB）及重組蛋白疫苗（rLTB-PorB）;通過鼻飼途徑將核酸疫苗和蛋白疫苗采用核酸初免-蛋白加強（DNA prime-p rotein boost）聯合免疫以及分別單獨免疫雌性BALB/c小鼠,同時設PBS及空質粒（pcDNA3.1（-））對照組,檢測各組體液免疫和細胞免疫應答水平。結果:免疫后第56天,聯合免疫組小鼠生殖道sIgA A450（1.083±0.179）、血清IgGA450（1.023±0.116）、脾淋巴細胞誘生的IL-4[（357.58±34.44）/pg/m l]和IFN-γ[（261.85±29.92）/pg/m l]水平均明顯高于各對照組（P＜0.01）,小鼠脾淋巴細胞增殖率（SI:2.12±0.29）較對照組顯著增高（P＜0.05）;核酸疫苗組、蛋白疫苗組和聯合免疫組血清IgG亞類IgG2a/IgG1比值分別為1.678、0.455和0.693。結論:LTB-PorB核酸疫苗和蛋白疫苗聯合免疫組誘導的特異性體液免疫應答和細胞免疫應答水平明顯優于單獨的核酸疫苗組和蛋白疫苗組,且以誘導Th2傾向性免疫應答為主。

淋病;孔蛋白B;大腸桿菌不耐熱腸毒素 B亞單位;核酸疫苗;蛋白疫苗;聯合免疫

淋球菌是引起淋病的病原菌,淋病是我國目前發病人數最多的性傳播疾病,感染淋球菌還可增加HIV傳播的危險性[1]。如何有效控制和預防淋病,成為全世界普遍關注的公共衛生問題,而研制出有效的疫苗,是預防和控制淋病的關鍵。淋球菌孔蛋白B（Porin B,PorB）是最具潛力的淋病疫苗候選抗原之一,大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位（B subunitof Escherichia coli heat-labile enterotoxin,LTB）是一種有效的粘膜佐劑[2],本課題組將二者結合構建LTBPorB融合基因的原核及真核表達載體。前期研究工作表明,單一LTB-PorB核酸疫苗免疫小鼠后能誘導一定水平的細胞免疫,單一LTB-PorB蛋白疫苗能誘導一定水平的體液免疫,但二者單獨免疫均難以同時誘導高水平的體液免疫和細胞免疫應答。目前采用不同類型的疫苗聯合免疫,如核酸初免-蛋白加強免疫（DNA prime-protein boost）策略被認為能有效提高疫苗的免疫效果[3]。本研究采用抗淋病LTBPorB核酸疫苗與蛋白疫苗聯合鼻飼免疫雌性BALB/c小鼠,探討其能否同時增強特異性體液免疫及細胞免疫應答水平,為研制高效抗淋病疫苗提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和實驗動物 pcDNA3.1（-）、pcDNA 3.1（-）/ltB-porB的E.coliJM109重組克隆菌、pET-30a、pET-30a/ltB-porB的E.coliBL21重組表達菌均由本室保存;PorB蛋白由本室提供;SPF級4～6周雌性BALB/c小鼠購自南華大學實驗動物學部。

1.1.2 主要試劑 質粒提取試劑盒（去內毒素）購自OMEGA公司;Ni-NTA6×His親和層析純化試劑盒購自Qiagen公司;一抗:兔抗淋球菌血清和兔抗霍亂弧菌腸毒素（Choleratoxin,CT）血清分別購自Abcam和Sigma公司;二抗:HRP標記羊抗鼠 IgG。gG1、IgG2a和sIgA分別購自Abcam和Sigma公司;Detoxi-GelTM內毒素去除膠購自Thermo Scientific公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 核酸疫苗及蛋白疫苗的制備 將本室保存的包含pcDNA3.1（-）、pcDNA3.1（-）/ltB-porB的E.coliJM109重組克隆菌擴增培養,提取質粒經PCR和BamHⅠ與HindⅢ雙酶切鑒定正確后,去內毒素質粒提取試劑盒大量提取真核質粒,核酸蛋白定量分析儀測定濃度后,調整核酸濃度為2 500μg/ml。將本室保存的包含pET-30a、pET-30a/ltB-porB的E.coliBL21重組表達菌擴增培養,對溫度、IPTG和時間等誘導表達條件進行系列摸索優化后,表達并獲得包涵體蛋白。對表達后重組蛋白（rLTB-PorB）分別以兔抗淋球菌血清為一抗,兔抗CT血清（LT與CT具有80%以上的同源性且免疫學性質十分相似,可用兔抗CT血清代替兔抗LT血清[4]）為一抗;HRP標記羊抗兔IgG為二抗,按文獻[5]操作,行Western blot鑒定后大量誘導表達,Ni-NTA親和層析純化柱pH梯度洗脫法純化蛋白并通過尿素梯度透析復性;去除重組蛋白內毒素后測定蛋白濃度并調整蛋白濃度為1 250 μg/ml。

1.2.2 動物免疫 將75只4～6周雌性BALB/c小鼠隨機分成A、B、C、D、E 5組,每組 15只:A組（PBS對照組）、B組（空質粒 pcDNA3.1（-）對照組）、C組（核酸疫苗pcDNA3.1（-）/ltB-porB組）、D組（蛋白疫苗rLTB-PorB組）、E組（聯合免疫 pcDNA3.1（-）/ltB-porB+rLTB-PorB組）;PBS 40 μl/次、pcDNA3.1（-）及核酸疫苗100μg/次、蛋白疫苗50μg/次,各組均于0、14、28、42天采用鼻飼途徑免疫 4次（聯合免疫組0、14天為核酸疫苗,28、42天為蛋白疫苗）。

1.2.3 免疫小鼠標本的收集 于0、14、28、42、56天收集小鼠生殖道灌洗液100μl;收集小鼠尾靜脈血50～80μl并分離血清,所有標本于-20℃保存;末次免疫結束后14天（第56天）,無菌分離各組小鼠脾淋巴細胞。

1.2.4 小鼠生殖道粘膜sIgA的檢測 用重組蛋白PorB抗原包被ELISA板,以各次收集的小鼠生殖道灌洗液為一抗,以酶標羊抗鼠sIgA為二抗,間接ELISA法檢測PorB特異性sIgA水平。

1.2.5 血清總IgG和亞類IgG1、IgG2a的檢測 用重組蛋白PorB抗原包被ELISA板,以各次收集的小鼠血清為一抗,以酶標羊抗鼠IgG為二抗,間接ELISA法檢測PorB特異性IgG水平;以末次免疫后14天（第56天）小鼠血清為一抗,分別以酶標羊抗鼠IgG1、IgG2a為二抗,間接ELISA法檢測PorB特異性IgG1、IgG2a 水平 。

1.2.6 脾淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ、IL-4的檢測 末次免疫后14天（第56天）常規方法無菌分離各組小鼠脾臟淋巴細胞,細胞計數,調整細胞濃度至6×106m l-1,加入24孔培養板中,1m l/孔;每組的每個培養孔中加入PorB抗原 10μg,37℃、5%CO2培養箱中孵育48小時,小心吸出上清,以ELISA試劑盒分別檢測上清中的IFN-γ、IL-4的水平,具體操作按試劑盒說明書進行。

1.2.7 脾淋巴細胞增殖實驗 末次免疫后14天（第56天）常規方法無菌分離各組小鼠脾臟淋巴細胞,細胞計數,調整細胞濃度至1×106m l-1,加入96孔培養板中,200μl/孔;每只小鼠脾細胞重復8孔,其中4孔為空白對照組,不加抗原;另4孔為實驗組,每孔加入 PorB抗原 2μg,混勻后,置 37℃、5%CO2培養48小時。于終止培養前4小時每孔加入5 mg/m l的噻唑藍（MTT）20μl,繼續培養4小時后棄上清,每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μl,震蕩溶解15分鐘,570 nm波長測定各孔的A570值。根據刺激指數（SI）大小來判斷增殖程度。SI=試驗組平均A570值/對照組平均A570值。

1.3 統計學處理 運用SPSS16.0軟件進行分析。抗體水平、脾細胞刺激指數及細胞因子水平以±s表示,組間均數的比較采用方差分析,以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 核酸疫苗及蛋白疫苗的鑒定 本室保存的pcDNA3.1（-）/ltB-porB經PCR和BamHⅠ與HindⅢ雙酶切均能得到預期目的條帶（圖1）。Western blot結果顯示,重組質粒pET-30a/ltB-porB表達純化產物（rLTB-PorB）與兔抗淋球菌血清和兔抗CT血清均能發生特異性反應,均在預期位置出現單一特異性目的條帶,而陰性對照組則沒有特異性條帶（圖2、3）。

圖1 真核重組載體的PCR和酶切鑒定圖譜Fig.1 PCR of eukaryotic recombinant and digested products with Bam HⅠ and H indⅢ

圖2 rLTB-PorB的W estern blot鑒定（以兔抗淋球菌血清為一抗）Fig.2 Analysis of rLTB-PorB by W estern b lot（with rabbit serum of anti-Neisseria gonorrhoeae）

2.2 小鼠生殖道粘膜抗PorB特異性sIgA的檢測PorB蛋白作為檢測用抗原,包被 ELISA板,間接ELISA 法對0、14 、28、42、56天收集的小鼠生殖道灌洗液中的sIgA進行檢測。結果顯示:在4次不同時間的免疫中,C組（pcDNA3.1（-）/ltB-porB）、D組（rLTB-PorB）、E組（pcDNA3.1（-）/ltB-porB+rLTB-PorB）sIgA水平呈上升趨勢,其中C組第 56天A450達0.542±0.040,效價高達 1∶320;D 組第 56 天A450達0.702±0.053,效價高達1∶1 280;E組第56天A450達1.083±0.179,效價高達1∶2 560;三組 sIgA 水平明均顯高于A 組（PBS組,A450:0.132±0.013）、B組（pcDNA 3.1（-）組,A450:0.127±0.025）,且 E組明顯高于C、D組（P＜0.01）,見圖4,結果說明誘導特異性粘膜免疫（sIgA）的水平,聯合免疫組＞蛋白疫苗組＞核酸疫苗組。

圖3 rLTB-PorB的Western blot鑒定（以兔抗CT血清為一抗）Fig.3 Analysis of rLTB-PorB by Western blot（with rabbit serum of anti-CT）

圖4 鼻飼小鼠生殖道灌洗液抗PorB特異性sIgA水平Fig.4 sIgA levels of PorB in five intranasally immunized groups

圖5 鼻飼小鼠血清抗PorB特異性IgG抗體水平Fig.5 IgG levels of PorB in five intranasally immunized groups

圖6 各組免疫小鼠IgG1、IgG2a水平Fig.6 IgG1 and IgG2a levels of PorB in five intranasally immunized groups

2.3 小鼠血清抗PorB特異性IgG的檢測 PorB蛋白作為檢測用抗原,包被ELISA板,間接ELISA法對0、14、28、42、56天收集的小鼠血清中的 IgG進行檢測。結果顯示:在4次不同時間的免疫中,C、D、E組 IgG水平呈上升趨勢,其中C組第56天A450達0.541±0.054,效價高達1∶1 280;D組第42天達最高,A450為0.772±0.091,效價高達1∶5 120;E組第56天A450達1.023±0.116,效價高達1∶20 480;三組 IgG 水平明均顯高于A組（A450:0.160±0.014）、B組（A450:0.151±0.037）,且E組明顯高于C、D組（P＜0.01）,見圖5,結果說明誘導特異性血清IgG的水平,聯合免疫組＞蛋白疫苗組＞核酸疫苗組。

2.4 小鼠血清抗PorB特異性IgG1、IgG2a的檢測PorB蛋白作為檢測用抗原,包被 ELISA板,間接ELISA法對末次免疫后14天（第56天）收集的小鼠血清中的 IgG1、IgG2a進行檢測。結果顯示:C組IgG1、IgG2a A450分別為0.345±0.054、0.579±0.055,IgG2a/IgG1為 1.678;D組 IgG1、IgG2a A450分別為0.789±0.202、0.359±0.080,IgG2a/IgG1為0.455,結果表明核酸疫苗組以誘導Th1型應答為主,而蛋白疫苗組以誘導Th2型應答為主;E組IgG1、IgG2a A450分別為 0.950±0.184、0.658±0.173,IgG2a/IgG1為0.693,結果表明聯合免疫組IgG2a和IgG1水平較C組或D組均有較大幅度升高,其中IgG1亞類升高的程度更為顯著,且C、D、E 、各組IgG1、IgG2a明顯高于A 組（A450:0.086±0.016、A450:0.071±0.019）、B 組（A450:0.093 ±0.013、A450:0.121±0.021,P＜0.01）,見圖6。

表1 免疫小鼠脾淋巴細胞刺激指數（SI）及鼠脾淋巴細胞培養上清IFN-γ、IL-4含量（pg/m l）Tab.1 Stimulation index,IFN-γand IL-4（pg/m l）in cultured supernatant of sp leen cells from immunizedm ice

2.5 MTT比色法檢測脾淋巴細胞的增殖反應 小鼠脾淋巴細胞經PorB蛋白刺激后的結果表明:C、D、E各組刺激指數（SI）明顯高于A組、B組（P＜0.01）;且E組明顯高于C、D組（P＜0.05）;C組亦明顯高于D組（P＜0.05）,見表1,說明小鼠脾淋巴細胞對PorB蛋白刺激的增值能力,聯合免疫組＞核酸疫苗組＞蛋白疫苗組。

2.6 免疫小鼠脾淋巴細胞培養上清中IFN-γ,IL-4含量檢測 按照說明書建立IFN-γ、IL-4標準方程,繪制標準曲線。檢測結果顯示:C、E兩組IFN-γ含量明顯高于A、B、D組（P＜0.01）,且E組明顯高于C、D組（P＜0.01）,但D組與A、B組之間無顯著性差異（P＞0.05）,見表1,說明小鼠脾淋巴細經PorB蛋白刺激誘導的IFN-γ水平,聯合免疫組＞核酸疫苗組＞蛋白疫苗組,但蛋白疫苗組未誘生出高水平的IFN-γ。C、D、E、各組 IL-4含量明顯高于A 組、B組（P＜0.01）,且E組明顯高于C、D組（P＜0.01）,D組亦明顯高于C組（P＜0.01）,見表1,說明小鼠脾淋巴細經PorB蛋白刺激誘導的IL-4水平,聯合免疫組＞蛋白疫苗組＞核酸疫苗組。

3 討論

DNA疫苗一經問世,就發現其可以誘發體液和細胞免疫應答,特別是在誘導CTL免疫應答方面是其它疫苗所不能比擬的。然而,在實際應用中,常因體內轉染效率欠佳等原因,核酸疫苗所激發的免疫應答強度相對較弱,尤其在大動物以及人體內不足以引起足夠的免疫保護效果[6]。用基因工程構建的重組蛋白疫苗一般均能誘導機體產生高滴度的抗體,但其誘導的細胞免疫水平常顯不足,保護效果有限[7,8],究其原因,可能與重組蛋白疫苗主要誘導機體產生Th2傾向性免疫應答有關。Zhu等[9,10]在淋球菌疫苗的研究中發現用重組蛋白PorB免疫BALB/c小鼠后,產生了高水平的體液免疫,但其誘導的細胞免疫卻相對不足;PorB核酸疫苗誘發的細胞免疫應答相對較強而體液免疫應答相對較弱。

目前,旨在提高疫苗免疫效果的方法有多種,其中將不同類型的疫苗采用初免-加強（Prime-Boost）策略是研究較多的一種方法。核酸疫苗和蛋白疫苗在誘導細胞免疫和體液免疫方面各有優勢,一般認為核酸疫苗以誘導細胞免疫應答為主,蛋白疫苗以誘導體液免疫應答為主[11]。研究者們認為采用核酸疫苗與蛋白疫苗聯合免疫,發揮兩種疫苗在機體內誘導免疫應答的不同優勢,可增強疫苗誘導機體產生特異性免疫應答的效果。近年來,在血吸蟲病、布魯桿菌病、瘧疾、弓形蟲病、日本腦炎、結核病、AIDS等疫苗的研究中發現,核酸疫苗初免后,繼而用相應蛋白疫苗加強免疫,其免疫應答水平和保護性免疫效果均較單一核酸疫苗或單一蛋白疫苗增高[12-14]。

本研究采用LTB-PorB核酸疫苗與蛋白疫苗通過鼻飼途徑聯合免疫雌性BALB/c小鼠,初步探討經核酸初免-蛋白加強（DNA prime-protein boost）聯合免疫后對誘導體液免疫和細胞免疫應答的增強作用。結果顯示:經4次免疫（聯合免疫組第1、2次為核酸疫苗,第3、4次為蛋白疫苗）后,核酸疫苗組、蛋白疫苗組和聯合免疫組小鼠的體液免疫及細胞免疫水平均明顯高于PBS及pcDNA3.1（-）對照組（P＜0.01）。核酸疫苗組在免疫后56天誘生了較高水平的細胞免疫應答:脾淋巴細胞誘生的 IFN-γ為175.70±23.68 pg/m l,脾淋巴細胞刺激指數（SI）為1.82±0.15;蛋白疫苗組誘生了較高水平的體液免疫應答:免疫后42天血清IgG A450為0.772±0.091,免疫后第56天生殖道sIgA A450為0.702±0.053,脾淋巴細胞誘生的IL-4為251.90±62.14 pg/m l;聯合免疫組誘導的體液免疫及細胞免疫應答水平均明顯高于核酸疫苗組或蛋白疫苗組（P＜0.01或P＜0.05）:免疫后56天生殖道sIgA A450為1.083±0.179,血清IgGA450為1.023±0.116,IL-4為357.58±34.44 pg/m l;IFN-γ為 261.85±29.92 pg/m l,SI為 2.12±0.29。此外,檢測血清IgG亞類,可以監測機體免疫應答類型的變化,IgG2a可反映Th1型細胞免疫應答水平,IgG1可反映Th2型體液免疫應答水平。本研究對免疫后56天各組小鼠血清IgG1、IgG2a的檢測顯示:核酸疫苗組IgG2a/IgG1比值（1.678）遠大于蛋白疫苗組（0.455）,結合SI、IFN-γ、sIgA、IgG 和 IL-4水平,初步表明LTB-PorB核酸疫苗主要誘導Th1型傾向性細胞免疫應答,而蛋白疫苗主要誘導Th2型傾向性體液免疫應答;聯合免疫組IgG2a和IgG1水平較核酸或蛋白疫苗組均有較大幅度升高,其中IgG1亞類升高的程度更為顯著,IgG2a/IgG1比值為0.693,IgG2a/IgG1 比值結合SI、IFN-γ、sIgA、IgG 和IL-4水平,初步表明聯合免疫組（DNA prime-protein boost）與單一核酸或蛋白疫苗組比較,能同時促進Th1型和Th2型免疫應答,且以誘導Th2傾向性免疫應答為主,與Juliana等[15]的結果基本一致。

核酸-蛋白疫苗聯合應用增強免疫應答的機制較為復雜,目前尚無明確定論。核酸-蛋白聯合免疫方法作為一種有希望增強疫苗免疫應答的策略,還需進一步探索和完善。抗淋病免疫主要為體液免疫,尤其是粘膜免疫。本研究LTB-PorB核酸疫苗與蛋白疫苗通過粘膜途徑聯合免疫,所誘導的體液免疫（包括特異性IgG和sIgA）和細胞免疫應答水平均明顯優于單一的核酸或蛋白疫苗,且以誘導Th2傾向性免疫應答為主,該研究結果可為研制高效抗淋病疫苗提供實驗依據。

1 UnemoM,PalmerHM,Blackmore Tetal.Global transmissionofprolyliminopeptidase-negative Neisseriagonorrhoeaestrains:implications for changes in diagnostic strategies[J].Sex Transm Infect,2007;83（1）:47-51.

2 PizzaM,GiulianiM M,Fontana M Retal.Mucosal vaccines:non toxic derivativesof LT and CT asmucosal adjuvants[J].Vaccine,2001;19（17-19）:2534-2541.

3 Ramsay A J,KentS J,Strugnell RAetal.Genetic vaccination strategies for enhanced cellular,humoral andmucosal immunity[J].Immunol Rev,1999;171:27-44.

4 Spangler BD.Structure and function of cholera toxin and the related Escherichia coli heat-labile enterotoxin[J].Microbiol Rev,1992;56（4）:622-647.

5 Sambrook J,Russell DW.黃培堂譯.分子克隆實驗指南[M].第 3版.北京:科學出版社,2002:1723-1726.

6 Zhengrong Cui.DNA vaccine[J].AdvGenet,2005;54:257-289.

7 戴志兵,胡四海,陳 敏etal.淋球菌porB和大腸桿菌ltB融合基因的構建、表達及其免疫活性[J].微生物學報,2010;50（4）:517-523.

8 吳 丹,王慶敏,陳蕊雯etal.豬囊尾蚴抗原 cC1 DNA疫苗和蛋白質疫苗聯合誘導小鼠免疫應答[J].第二軍醫大學學報,2004;25（1）:34-36.

9 ZhuW,Thomas C E,Chen C Jetal.Comparison of immune responses to gonococcal PorB delivered as outermembrane vesicles,recombinant protein,orVenezuelan equine encephalitis virus replicon partic les[J].Infect Immun,2005;73（11）:7558-7568.

10 Zhu W,Thomas C E,Sparling P F.DNA immunization of mice with a plasmid encoding Neisseria gonorrhea PorB protein by intramuscular injection and epidermal particle bombardment[J].Vaccine,2004;22（5-6）:660-669.

11 戴志兵,胡四海.核酸疫苗與蛋白疫苗的免疫特點及其聯合免疫的研究進展[J].國際免疫學雜志,2010;33（2）:89-91,96.

12 Shang L,Liu Q,Liu Wetal.Protection inm ice immunized with a heterologous prime-boost regime using DNA and recombinant pseudorabies expressing TgSAG1 against Toxoplasma gondii challenge[J].Vaccine,2009;27（21）:2741-2745.

13 Li P,Cao R B,Zheng Q Setal.Enhancement of humoral and cellular immunity inm iceagainst Japanese encephalitis virususing aDNA primeprotein boost vaccine strategy[J].Vet J,2010;183（2）:210-216.

14 Wang S,Kennedy JS,West Ketal.Cross-subtype antibody and cellular immune responses induced bya polyvalent DNA prime-protein boostHIV-1 vaccine in healthy human volunteers[J].Vaccine,2008;26（8）:1098-1110.

15 Juliana Cassataro,Carlos A Velikovsky,Laura Brunoetal.Improved immunogenicity of a vaccination regimen combining a DNA vaccine encoding brucellamelitensisoutermembrane protein 31（Omp31）and recombinant omp31 boosting[J].Clinical and Vaccine Immunology,2007;14（7）:869-874.

[收稿2010-01-28 修回2010-05-26]

（編輯 許四平）

Improved immunologic responses of a vaccination regimen combining a DNA vaccine encoding LTB-PorB and recombinant LTB-PorB boosting

DAIZhi-Bing,HUSi-Hai,LIUQing-Nan,CHENMin,WANGYu-Feng,ZHANGYu-Kuai,YUMin-Jun,ZHUCui-Ming,LIZhong-Yu,LUChun-Xue.PathogenicBiologyInstitute,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China

Objective:To explore the improved immunological responses induced by a LTB-PorBDNA vaccine prime-p rotein boost immunization regimen.Methods:A LTB-PorBDNA vaccine（pcDNA3.1（-）/ltB-porB）and recombinant LTB-PorB（rLTB-PorB）were prepared.Female BALB/cmicewere inoculatedwith a LTB-PorBDNA vaccine followed by boosting with rLTB-PorB through intranasal immunization at the days 0,14,28,42.Then humoral and cellu llar immunological responses were detected in female BALB/c mice by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）andmethyl thiazolyl tetrazolium（MTT）colorimetric assay.Results:In the DNA vaccine prime-protein boostgroup at day 56,A450of sIgA in genital tract（1.083±0.179）,serum IgGA450（1.023±0.116）,levels of IL-4（357.58±34.44 pg/m l）and IFN-γ（261.85±29.92 pg/ml）,both ofwhichwere inducedwith splenic lymphocytes,were significantly higher than in controls（P＜0.01）,and the stimulation index（2.12±0.29）of splenic lymphocyteswas also significantly higher than in controls（P＜0.05）.The ratios of serum IgG2a/IgG1 in the DNA vaccine group,recombinantp rotein group and the DNA vaccine prime-protein boostgroupwere 1.678,0.455 and 0.693 respectively.Conclusion:The DNA vaccine p rime-protein boost immunization regimen cou ld enhance both humoral and cellullar immunologic responses in BALB/cmice,especially for Th2 humoral immunological response,when comparedwith a LTB-PorBDNA vaccine or a recombinant protein immunization alone.

Gonorrhea;Porin B;LTB;DNA vaccine;Protein vaccine;Combined immunization

R392.12

A

1000-484X（2010）12-1059-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.001

①本文為國家自然科學基金（30771931）和湖南省教育廳科研基金（08C745）資助項目

②湖南益陽醫學高等專科學校,益陽413000

戴志兵（1980年-）,男,在讀碩士,主要從事淋球菌疫苗研究,現就職于湖南益陽市中心醫院,E-mail:daizhibing1980@163.com;

及指導教師:胡四海（1957年-）,男,教授,碩士生導師,主要從事抗感染免疫研究,E-mail:hhsshh-518@163.com。

·專題綜述·