利用生物芯片技術檢測人參皂苷Rg1對小鼠樹突狀細胞功能調控相關基因表達的影響①

周英武 彭桂英 顧立剛 殷勝駿

（北京中醫藥大學中醫藥防治病毒性疾病教育部重點實驗室,北京 100029）

利用生物芯片技術檢測人參皂苷Rg1對小鼠樹突狀細胞功能調控相關基因表達的影響①

周英武 彭桂英 顧立剛 殷勝駿

（北京中醫藥大學中醫藥防治病毒性疾病教育部重點實驗室,北京 100029）

目的:利用基因芯片技術檢測人參皂苷Rg1對小鼠骨髓來源DC細胞功能調控相關基因表達的影響。方法:分離C57小鼠骨髓細胞,經GM-CSF、IL-4體外誘導培養6天的未成熟DC細胞（iDC）經不同因素處理并分為:對照組（Ⅰ）、人參皂苷Rg1組（Ⅱ）、內毒素（LPS）組（Ⅲ）、Rg1+LPS組（Ⅳ）,24小時后收集各組細胞,抽提總RNA,利用樹突狀和抗原呈遞細胞基因芯片對細胞功能相關基因進行檢測。結果:（Ⅱ/Ⅰ）上調≥2倍基因23個,下調≥2倍基因45個;（Ⅲ/Ⅰ）上調≥2倍基因15個,下調≥2倍基因47個;（Ⅳ/Ⅱ）上調≥2倍基因35個,下調≥2倍基因15個;（Ⅳ/Ⅲ）上調≥2倍基因37個,下調≥2基因10個。這些基因功能主要涉及細胞因子分泌及其受體表達、抗原攝取、抗原提呈、細胞表面受體、信號傳導。結論:人參皂苷Rg1對DC作用涉及多個基因的表達調控,這些基因控制并影響著DC功能、分化和成熟,為進一步尋找藥物靶點提供了線索。

人參皂苷Rg1;樹突狀細胞;基因芯片

人參具有的補氣生血和扶正祛邪等功效與其調 節機體免疫系統功能密切相關,人參皂苷單體Rg1（ginsenoside Rg1）是人參三醇組皂苷的一個代表性單體,被認為是其主要活性成分,對心血管、神經系統及免疫功能等具有廣泛的藥理作用[1-3]。樹突狀細胞（Dendriticcell,DC）是機體內最重要、功能最強的專職抗原提呈細胞,它啟動并連接了天然免疫和獲得性免疫,特異性地激活T、B淋巴細胞,通過募集炎性分子在炎癥部位的聚集以及自身在病灶的浸潤,參與炎性反應[4,5]。前期研究表明,人參皂苷Rg1具有促進成熟樹突狀細胞表面粘附分子和共刺激分子的表達,刺激T細胞增殖等作用[6]。為進一步探討其調控機制,我們采用了基因芯片技術,檢測人參皂苷Rg1對DC細胞功能調節相關基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人參皂苷Rg1購于中國藥品生物制品檢定所（批號 110703-200424）,淡黃色粉末,用RPM I1640溶液配制成2 mg/m l的溶液,并用0.22 μm的濾器（Millpore）過濾除菌;TRIZOL試劑（Invitrogen life technologies）;Oligo Dendritic&Antigen Presenting CellGene Array（OMM-406,SuperArray）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及分組處理 按照文獻[7]略做改進,制備樹突狀細胞。無菌條件下取C57小鼠骨髓細胞,計數,用完全 RPMI1640培養基調節濃度為1×106個/m l細胞懸液接種于培養皿中,并加入GMCSF（終濃度為40 ng/m l）及IL-4（終濃度為20 ng/m l）,37℃,5%CO2條件下培養6天。第3、5天半量換液,并補充相應細胞因子。在培養的第6天將iDC進行分組,經不同處理:對照組（Ⅰ）不做任何處理;人參皂苷Rg1組（Ⅱ）加入 Rg1使其終濃度為40 μg/ml;LPS組（Ⅲ）加入LPS使其終濃度為1μg/ml;人參皂苷Rg1+LPS組（Ⅳ）分別加入人參皂苷Rg1和LPS使其終濃度分別為40μg/m l和1μg/ml;37℃,5%CO2條件下培養24小時后,收集各組細胞。

1.2.2 RNA抽提及質量檢測 加入TRIZOL試劑反復吹打裂解細胞,抽提RNA,用DNaseⅠ消化RNA樣品,去除其中可能含有的基因組DNA,然后用RNeasy MinEluteTM純化試劑盒（Qiagen）純化所得RNA,紫外吸收測定法和變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度和純度。

1.2.3 cDNA標記與合成 將樣品RNA進行逆轉錄反應合成cDNA,在逆轉錄反應液中加入RNA擴增緩沖液,生物素標記的UTP和擴增酶類混合液,合成生物素標記的cRNA探針,然后使用SuperArray ArrayGrade cRNA純化試劑盒純化cRNA探針。

1.2.4 芯片雜交 將純化的cRNA探針在GEAhyb雜交液中與Oligo GEA rray芯片雜交。

1.2.5 化學發光檢測 探針與芯片雜交后,加入鏈親和素偶聯的堿性磷酸酶（AP）及化學發光底物反應。X射線膠片曝光后,在膠片上顯示檢測結果。

1.2.6 圖像采集和數據分析 X射線曝光膠片后,將膠片上的圖像掃描并轉換為灰度TIFF格式的圖片文件。運行ScanAlyze軟件,將灰度TIFF格式圖片的點陣轉化為數字型數據,將此原始數據儲存為M icrosoft Excel文件。運用GEA rray表達分析配套軟件（GEArray Expression Analysis Suite）進行完整的芯片數據分析。

2 結果

2.1 RNA提取并鑒定 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的RNA溶液A260/A280的比值在1.8～2.0之間。變性瓊脂糖凝膠電泳RNA條帶清晰,28S∶18S rRNA條帶亮度接近 2∶1,結果見圖 1。

2.2 基因芯片檢測結果分析

2.2.1 基因芯片分析 芯片上包含260個與抗原提呈細胞功能相關的基因,另外包括管家基因7個、陰性對照基因及背景點等28個,共計12行、24列。為監控芯片雜交體系的整個過程,在芯片上設置陰性對照,雜交時信號很低,說明背景低。此外管家基因轉錄水平平均無顯著變化,說明芯片的結果具有良好的穩定性和可靠性,結果見圖2。

2.2.2 差異基因的統計 使用6μg的cRNA樣品,是芯片上的大部分表達豐度較高的基因信號。經終濃度為40μg/m l的人參皂苷Rg1和 1μg/m l LPS處理24小時后,人參皂苷Rg1組與對照組相比較（Ⅱ/Ⅰ）上調≥2倍基因23個,下調≥2倍基因45個;LPS組與對照組相比較（Ⅲ/Ⅰ）上調≥2倍基因15個,下調≥2倍基因 47個;人參皂苷 Rg1+LPS組與人參皂苷 Rg1組相比（Ⅳ/Ⅱ）上調≥2倍基因35個,下調≥2倍基因 15個;人參皂苷 Rg1+LPS組與LPS組相比（Ⅳ/Ⅲ）上調≥2倍基因37個,下調≥2倍基因10個。表1和表2顯示的是差異表達值高于5倍或小于0.2倍。

圖1 RNA變性瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 RNA denaturing agarose gelelectrophoresis

圖2 基因芯片掃描結果Fig.2 The Results ofm icroarray after scan

表1 差異表達明顯上調的基因（大于5）Tab.1 Significant up-regulation of gene expression（above 5）

表2 差異表達明顯下調的基因（小于0.2）Tab.2 Significant down-regulation of gene expression（below 0.2）

3 討論

人參皂苷Rg1是人參的主要活性物質,具有增強免疫力及抗衰老活性。有研究表明,Rg1可通過增強前體DC與血管內皮細胞的粘附,從而促進DC前體細胞的移行和發育成熟;增加DC分泌IL-12 P40蛋白及其mRNA的轉錄,刺激T細胞的增殖及增強LPAK細胞殺傷腫瘤的活力,具有啟動和增強免疫應答的作用,但其機制有待進一步研究[8,9]。基因芯片是一種特異、高效、快速的現代檢測技術,被廣泛用于免疫學研究,如免疫細胞的分化、成熟、活化以及表型的改變,它能同時檢測上千個基因的變化,全面反映細胞基因變化水平。現代免疫學認為,基因變化與免疫藥理存在一定聯系,在研究藥物對機體免疫系統的調節,尋找藥物靶向,基因芯片更體現其優越性,可以為中藥藥理研究提供了一種有效途徑[10]。

DC是最強的抗原提呈細胞,能活化初始T細胞,是特異性免疫應答的啟動因素[11]。本實驗取C57小鼠骨髓來源細胞,用人參皂苷Rg1處理,基因芯片檢測不同狀態DC功能相關基因的表達,研究發現,不同劑量濃度 Rg1作用于DC,發現40μg/ml濃度能顯著促進樹突狀細胞分泌IL-12等細胞因子,因此基因芯片分析采用此濃度。同時發現,經人參皂苷Rg1處理后的DC,不論是在成熟還是非成熟階段,其功能相關基因表達都發生了明顯變化,這些基因對DC的遷移、抗原攝取、抗原吞噬、抗原提呈以及自身分化成熟起著至關重要的作用。初步研究顯示,人參皂苷Rg1和LPS對iDC作用主要表現為協同促進作用,在一定意義上可認為,人參皂苷Rg1促進了mDC的功能。這些基因在DC發育的不同階段,其表達水平可以一致,也可不同,有時甚至相反。如:在iDC階段,人參皂苷 Rg1促進了 Anpep、Areg、ccl25 、cd2 、cd1d1、cd5、Csf3、Cxcl1、Ifi44 、Ifit1、IL-12b 、IL-17f、IL-1a、IL-4、Lta、Mx2、Tnfrsf11 基因表達,在與LPS共同作用于DC細胞后,這些基因的表達仍然處于一種高水平狀態,這種一致性說明,人參皂苷Rg1促進了DC的基因表達。其中,cd2、cd1d1、Mx2具有抗原呈遞攝取功能;Anpep、Ifi44、Ifit1、Lta為信號傳導分子;cd5是細胞表面受體 ;A reg、ccl25、Csf3、Cxcl1、IL-1a、IL-4、IL-12b、IL-17f、Tnfrsf11b 是細胞因子、趨化因子及其受體。以上結果表明人參皂苷Rg1對DC的調控可能涉及到多個靶點。

從實驗結果發現,在Ⅳ/Ⅲ（即LPS+Rg1組/LPS組）差異表達基因中,Erbb2和Ifi44均高表達。Erbb2作為細胞表面膜受體,是表皮生長因子受體（EGFR）家族成員之一[12];而Ifi44又稱p44,位于胞漿內,是IFN-α/β的誘導基因,是干擾素抗病毒途徑中的一個重要分子[13]。考慮到Erbb2是EGFR家族成員,我們認為Rg1可能通過和DC表面EGFR相結合,從而啟動EGFR-p44MAPK信號通路從而產生下游的作用。而且單純用Rg1刺激DC,也發現Ifi44轉錄水平明顯增高（比值為2.8）,進一步證實我們推測的可能性。

此外,我們用ELISA檢測人參皂苷Rg1影響DC分泌IL-12和IL-4的情況（數據待發表）,發現二者均上調,這也和基因芯片結果（IL-12和IL-4差異表達值分別為3.84和2.57）一致,一方面證明基因芯片結果的可靠性,另一方面表明人參皂苷Rg1影響DC的功能,誘導了混合型Th1/Th2免疫反應,這與人參具有的雙向調節作用一致。

綜上所述,人參皂苷Rg1對DC功能調控涉及多基因、多靶點,這些基因貫穿了DC分化、成熟與凋亡整個過程,控制著DC的細胞因子分泌、受體表達、吞噬和抗原提呈功能。但有關EGFR-p44MAPK信號通路以及差異表達明顯上調的相關蛋白功能還有待進一步研究確定。

1 ChengY,Shen LH,Zhang JT.Anti-amnestic and anti-aging effectsofginsenoside Rg1 and Rb1 and itsmechanism of action[J].Acta Pharmacol Sin,2005;26（2）:143-149.

2 Zhang JT.Nootropicmechanisms of ginsenoside Rg1--influence on neuronal plasticity and neurogenesis[J].Acta Pharm Sin,2005;40（5）:385-388.

3 Zhao CH,Chen XC,Zhu Y Getal.Rolesof telomere and telomerase in the processofginsenoside Rg1 protection against tert-butyl hydroperoxideinduced senescence in WI-38 cells[J].Chin Pharmacol Bull,2005;21（1）:61-66.

4 Gervais A,ToutiraisO,Bouet-Toussaint Fetal.In vitro antitumor lymphocyte generation using dendritic cells and innate immunity mechanisms as tumor cell treatments[J].Anticancer Research,2007;27（4B）:2385-2392.

5 Watanabe S,YamakawaM,HiroakiTetal.Correlation of dendritic cell infiltration with active crypt inflammation in ulcerative colitis[J].Clin Immunol,2007;122（3）:288-297.

6 王 毅,郝 鈺,邱全瑛etal.人參皂甙Rg1、Rh1對樹突狀細胞刺激T細胞增殖及LPAK抗腫瘤活性的影響[J].中國免疫學雜志,2003;19（4）:248-252.

7 Boudreau J,Koshy S,Cummings D,Wan Y.Culture ofmyeloid dendritic cells from bonemarrow precursors[J].JVis Exp,2008;25（17）:769-769.

8 王 毅,王本祥,劉鐵漢etal.人參皂苷Rg1的腸內菌代謝Ⅱ.人參皂苷Rg1和Rh1免疫活性[J].中國藥理學報（英文版）,2000;21（9）:792-796.

9 王 毅,郝 鈺,婁金麗etal.人參皂苷Rg1和 Rh1對樹突狀細胞功能的影響[J].中國病理生理雜志,2004;20（10）:1764-1764.

10 馬宇瀅,張新民.基因芯片技術在免疫學研究中的應用及其對中醫藥研究的啟發[J].中西醫結合學報,2004;2（2）:90-93.

11 Stuart LM,LucasM,Simpson Cetal.Inhibitory effectsof apoptotic cell ingestion upon endotoxin-drivenmyeloid dendritic cellmaturation[J].J Immunol,2002;168（4）:1627-1635.

12 Alison Reid,Laura Vidal,Heather Shawetal.Dual inhibition of ErbB1（EGFR/HER1）and ErbB2（HER2/neu）[J].Euro JCancer,2007;43（3）:481-489.

13 Lin L,Hwang Y,Chen E Y.Gene-gene and gene-environmentinteractions in interferon therapy for chronic hepatitis C[J].FutureMedicine,2007;8（10）:1327-1335.

[收稿2010-04-29 修回2010-07-09]

（編輯 倪 鵬）

Identification of the regulatory effect of Ginsenoside-Rg1 on functional regulation gene expressing in murine dendritic cell by bio-chip technology

ZHOUYing-Wu,PENGGui-Ying,GULi-Gang,YINSheng-Jun.KeyLaboratoryofChineseMedicineonViralInfectious Disease,BeijingUniversityofChineseMedicine,MinistryofEducation,Beijing100029,China

Objective:cDNA microarrary technique was emp loyed to detect the effects of ginsenoside-Rg1 on functional regu lation of gene expressing inmurinemarrow-derived dendritic cells.Methods:Immature dendritic cells（iDC）derived from bonemarrow of C57m ice were induced by GM-CSF and IL-4 for six days in vitro and

different treatments for 24 h.Then the cellswere divided into themedia control group（Ⅰ）,ginsenoside Rg1 group（Ⅱ）,LPSgroup（Ⅲ）and ginsenoside Rg1 plus LPSgroup（Ⅳ）.24 h later,total RNA of the cells was collected,and four chips ofOligo Dendritic&Antigen Presenting CellGene Array were used to investigate the transcription levels of the functional genes from dendritic cells.Results:Therewere twenty-three genes up-regulated and forty five genes down-regulated two-folds above inⅡ/Ⅰ;fifteen genes up-regulated and forty seven genes down-regulated two-folds above inⅢ/Ⅰ;thirty fivegenesup-regulated and fifteen genes down-regulated two-folds above inⅣ/Ⅱ;thirty seven genes up-regulated and ten genes down-regulated two-folds above inⅣ/Ⅲ.The function of these genes involves the secretion of the cytokines and the exp ression of their receptors,antigen uptake and p resentation,cell surface receptors and signal transduction.Conclusion:The effects of ginsenoside-Rg1 on dendritic cell involve in multi-regulation and expression of geneswhich contribute to the functions,differentiation and maturation of the dendritic cells.This study provides a clue to further seek the target ofmedicine.

Ginsenoside-Rg1;Dendritic cell;Microarrary

R285.5

A

1000-484X（2010）12-1086-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.007

①本文為國家自然科學基金青年科學基金資助項目（No.30701105）

周英武（1974年-）,男,在讀博士,講師,主要從事中醫藥免疫調節的分子機制研究,E-mail:zhouyingwuhn@163.com;

及指導教師:彭桂英（1978年-）,女,博士,副教授,主要從事中醫藥免疫調節的分子機制研究,E-mail:penggy@bucm.edu.cn。