IL-10、MD-1基因單核苷酸多態性與哮喘易感性的相關性研究①

孫敏英 李粉霞 楊學習 李 明 （南方醫科大學生物技術學院抗體工程研究所,廣州 510515）

IL-10、MD-1基因單核苷酸多態性與哮喘易感性的相關性研究①

孫敏英 李粉霞 楊學習 李 明②（南方醫科大學生物技術學院抗體工程研究所,廣州 510515）

目的:分析IL-10基因 rs1800896、rs3024492位點和髓樣分化蛋白1（Myeloid differentiation1,MD-1）基因rs7740529、rs2233128位點單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism,SNP）與哮喘遺傳易感性的相關性以及過敏性鼻炎（Allergic rhinitis,AR）對哮喘遺傳易感性的影響。方法:應用Sequenom MassARRAY○RSNP分型技術對141例哮喘患者和145例正常對照的四個SNP位點（rs1800896、rs3024492、rs7740529、rs2233128）進行基因分型,再將哮喘患者中確定有過敏性鼻炎和無過敏性鼻炎者分別與正常對照組比較。χ2檢驗統計分析病例組和對照組的基因型頻率;采用非條件Logistic回歸校正年齡、性別影響,計算比數比（OR）和95%可信區間（CI）,以此評價各位點多態性與哮喘遺傳易感性的相關性以及過敏性鼻炎對哮喘易感性的影響。結果:（1）IL-10 rs1800896多態性位點GG、GA、AA三種基因型分布頻率在哮喘組、哮喘和過敏性鼻炎共患組、哮喘而無鼻炎組的分布頻率和對照組相比,差異均有統計學意義（P＜0.001）,有無過敏性鼻炎對其影響不明顯。相較GG或AA基因型,攜帶基因型GA的個體,哮喘的患病風險明顯降低（OR=0.033,95%CI:0.017～0.065）。（2）MD-1 rs7740529位點 CC、CT、TT三種基因型分布頻率在哮喘患者組、哮喘和過敏性鼻炎共患組、哮喘而無鼻炎組的分布頻率和對照組相比,差異也均有統計學意義（P≤0.005）,有無過敏性鼻炎對其影響不明顯。相比較CC或TT基因型,攜帶基因型CT的個體,哮喘的患病風險明顯降低（OR=0.369,95%CI:0.225～0.606）。（3）IL-10 rs3024492位點TA、AA基因型和MD-1 rs2233128位點AG、GG基因型在哮喘人群中的分布頻率與對照組相比無統計學意義（P＞0.05）。結論:IL-10 rs1800896與MD-1 rs7740529位點多態性與哮喘的遺傳易感性相關,其雜合型的患病風險均明顯降低,且有無過敏性鼻炎對其影響不明顯。

IL-10;MD-1;哮喘;單核苷酸多態性;易感性

哮喘是一種慢性的呼吸系統疾病,是由多種細胞特別是肥大細胞、嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞參與的慢性氣道炎癥,患者表現為周期性的呼吸困難、胸部收縮、咳嗽等癥狀。哮喘的發病是由遺傳、免疫和環境因素綜合作用的結果,通常由過敏癥引起,其過程中有多種細胞因子參與。研究表明哮喘發病與許多易感基因相關[1]。過敏性鼻炎是鼻粘膜的變應性疾病,主要癥狀為噴嚏、鼻癢、流涕和鼻堵。二者均為呼吸道炎癥性疾病,在致病誘因、發病機制等方面均非常相似,只是病變部位不同。調查顯示,哮喘患者60%患有過敏性鼻炎,而過敏性鼻炎的患者發生哮喘的危險性相當于正常人群的8倍[2]。可見二者的發病有一定的相關性,即所謂“同一氣道,同一疾病”學說[3,4]。以往的基因易感性研究大多只分析哮喘或過敏性鼻炎而沒有考慮二者之間的聯系。為此,我們對哮喘和過敏性鼻炎共患以及哮喘而無過敏性鼻炎者分別加以分析,以確定哮喘的基因易感性以及過敏性鼻炎對其的影響。

IL-10是一種重要的免疫調節類細胞因子,主要由Th2細胞、單核/巨噬細胞、B淋巴細胞和角化細胞等產生,是Th2型細胞因子中最重要的成員之一。IL-10具有很強的炎癥抑制作用,能夠誘導T細胞對抗原的免疫耐受,在哮喘和過敏性疾病的發病中發揮重要的抗炎作用[5,6]。髓樣分化蛋白-1（Myeloid differentiation 1,MD-1）是一種表達于B細胞和樹突狀細胞（Dendritic cells,DC）表面的免疫調節分子,可以和radioprotective（RP）105形成復合體而與TLR4（Toll-like receptor4）相互作用。TLR4信號分子參與多種疾病的發生過程,如哮喘和過敏性疾病、腸炎等,還可以增加感染的易感性[7-9]。本研究選取IL-10基因啟動子區的 rs1800896、第三內含子區的rs3024492和MD-1基因第一內含子區的rs7740529、3′端的rs2233128這四個多態性位點進行分析研究,探討IL-10和MD-1的基因多態性對哮喘遺傳易感性的影響。在此基礎上,我們進行了過敏性鼻炎對哮喘易感性的影響比較分析,以排除過敏性鼻炎的干擾,進一步揭示哮喘的發病機理。

1 材料與方法

1.1 材料 研究材料為哮喘患者或正常對照外周血,取自廣州地區漢族人群且相互間無血緣關系,其中病例組141例,男69例,女72例,平均年齡42.20±16.267,選自南方醫院呼吸科。正常對照組145例,男89例,女56例,平均年齡 43.97±20.690。為該院同期健康體檢人員,無哮喘史,無過敏史。

1.2 方法

1.2.1 提取基因組DNA 用北京天根生物科技有限公司全基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Genom ic DNA Kit）提取DNA,樣品于-70℃保存備用。

1.2.2 設計引物 針對 rs1800896、rs3024492、rs7740529、rs2233128四個SNP位點,采用Sequenom MassARRAY Assay Design 3.1（美國Sequenom公司）進行引物設計,上海英駿生物公司（Invitrogen）負責引物合成。

1.2.3 基因分型分析 利用Sequenom MassARRAY○RSNP分型技術對以上四個位點進行基因分型。步驟如下:（1）擴增目的基因片段:將適量基因組DNA按一定順序分別加至384孔板,再添加PCR擴增體系使反應物的終濃度如下:Taq聚合酶0.1 U,基因組DNA 5 ng,PCR引物各2.5 pmol,dNTP 2.5 mmol。PCR反應條件為:95℃15分鐘,然后95℃20秒,56℃30秒,72℃30秒循環45次,72℃5分鐘。（2）SAP反應:添加0.3U的堿性磷酸酶去除剩余的dNTP。條件為:37℃40分鐘,85℃5分鐘。（3）單堿基延伸:添加各5.4 pmol的延伸引物,50μmol的dNTP/ddNTP混合物,0.5 U的Thermosequenase DNA聚合酶,反應條件為:94℃2分鐘,然后94℃5秒,50℃5秒,72℃5秒循環40次,72℃3分鐘。（4）脫鹽、上機:反應產物用樹脂脫鹽15分鐘后經自動點樣儀點樣于SpectroCHIP（Sequenom）芯片,再用基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜（SpectroREADER,Sequenom）檢測芯片。

1.3 統計學分析 將病例組和對照組基因型頻數進行哈代-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium,HWE）檢驗,采用SPSS13.0軟件進行數據分析,卡方檢驗分析病例組和對照組中基因型的分布差異,二分類logistic回歸校正性別和年齡的影響后進行危險度分析。再將病例組中確定有過敏性鼻炎和無過敏性鼻炎者分別與對照組進行比較,以分析過敏性鼻炎對哮喘易感性的影響。所有的統計檢驗均為雙側概率檢驗,P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 引物設計結果 針對rs1800896、rs3024492、rs7740529、rs2233128四個多態性位點的DNA序列,用Sequenom MassARRAY Assay Design 3.1設計各個位點的多重PCR特異性擴增引物和單堿基延伸引物,引物序列見表1。

2.2 IL-10基因多態性分析 rs1800896位點在廣州地區存在GG、GA、AA多態性,特征性質譜圖見圖1-A。統計分析結果如表2所示,GG、GA、AA三種基因型分布頻率在哮喘患者組（5.7%、81.6%和12.8%）、哮喘和過敏性鼻炎共患組（4.4%、77.8%和17.8%）、哮喘而無鼻炎組（6.7%、84.4%和8.9%）與對照組（0%、15.2%和 84.8%）相比,差異均有統計學意義（P＜0.001）,并且不受過敏性鼻炎的影響。二分類logistic回歸分析顯示,在校正年齡、性別影響后,同GG和AA型相比,攜帶基因型GA者患哮喘的危險性降低（OR=0.033,95%CI:0.017～0.065）。

rs3024492位點在廣州地區僅存在TA和AA多態性,特征性質譜圖見圖1B。但TA和AA兩種基因型的分布頻率在哮喘患者組（0.7%和99.3%）和對照組（2.1%和97.9%）相比,差異無統計學意義（表2）。

2.3 MD-1基因多態性分析 rs7740529位點在廣州地區存在CC、CT、TT多態性,特征性質譜圖見圖1C。統計分析結果（表2）表明,CC、CT、TT三種基因型分布頻率在哮喘患者組（30.9%、63.3%和5.8%）、哮喘和過敏性鼻炎共患組（22.7%、68.2%和9.1%）、哮喘而無鼻炎組（31.1%、66.7%和2.2%）的分布頻率和對照組（46.9%、40.7%和12.4%）相比,差異均有統計學意義（P≤0.005）,并且不受過敏性鼻炎的影響。二分類logistic回歸分析顯示,在校正年齡、性別影響后,同CC和TT型相比,攜帶基因型CT者患哮喘的危險性降低（OR=0.369,95%CI:0.225～0.606）。

rs2233128位點在廣州地區僅存在AG和GG多態性,特征性質譜圖見圖1D。但AG和GG兩種基因型的分布頻率在哮喘患者組（2.8%和97.2%）和對照組（7.6%和92.4%）相比,差異無統計學意義（表2）。

表1 rs1800896,s3024492,7740529和2233128四個多態性位點引物序列Tab.1 The p rimers of rs1800896,rs3024492,rs7740529 and rs2233128

表2 rs1800896、rs3024492、rs7740529和rs2233128多態性統計分析Tab.2 The statisticalanalysis of rs1800896,rs3024492,rs7740529 and rs2233128

圖1 rs1800896、rs3024492、rs7740529和 rs2233128多態位點特征性質譜圖Fig.1 Schematic of rs1800896,rs3024492,rs7740529 and rs2233128 polymorphisms

3 討論

單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism,SNP）主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳變異中最常見的一種,占所有已知多態性的90%以上。SNP因具有數量多、分布廣、適于快速、規模化篩查、易于基因分型等優點使其成為第三代遺傳標志,可用于高危群體的發現、疾病相關基因的鑒定、藥物的設計和測試以及生物學的基礎研究。本研究采用Sequenom MassARRAY○RSNP檢測系統,其基本原理為基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOFMS）技術[10]。主要特點是采用高密度SpectroCHIP○R點陣芯片,按照 A 、T、G 和 C 的信號強度及質量差異得出模板序列信息,高效快速,適合SNPs的大規模篩查[11]。

哮喘是一種具有明顯家族聚集傾向的多基因遺傳病。目前我國哮喘患病率約為1%,兒童可高達3%,且呈上升趨勢。過敏性鼻炎和哮喘之間的關系十分密切,二者同為呼吸道炎癥性疾病,致病誘因、免疫功能異常（都為Ⅰ型變態反應）、病理改變和發病機制非常相似,可以相互影響、相互促進,只是病變部位有所差異,可同時或先后出現[12,13]。Guerras等通過巢式病例對照研究確定過敏性鼻炎引發支氣管哮喘的相對危險度是4.13（OR=4.13）[14]。也有發現,鼻炎患者中外周血總IgE和EOS計數增高是并發哮喘的重要因素[15],即使目前并無哮喘癥狀的過敏性鼻炎患者,其氣道的病理變化與哮喘患者也十分相似[16]。鑒于哮喘和過敏性鼻炎的密切聯系,在分析基因多態性與哮喘易感性時有必要考慮過敏性鼻炎的影響。

IL-10基因位于第1號染色體,表達水平在很大程度上受遺傳控制[17]。實驗證實,同正常對照相比,哮喘患者中IL-10水平明顯降低[18,19]。IL-10可能是通過抑制T細胞增殖和分泌細胞因子、誘導免疫無能T細胞產生、抑制抗原提呈細胞的作用和特異性IgE分泌而抑制哮喘的發生發展。已有證實IL-10基因啟動子區多態性與哮喘的發病及疾病的嚴重程度有關[20]。MD-1位于第6號染色體,其產物是一種表達于B細胞和樹突狀細胞（Dendritic cells,DC）表面的免疫調節分子,結構和功能與Toll樣受體（Toll-like receptor,TLR）家族分子RP105相關聯,在免疫反應中發揮重要的調節作用,與多種炎癥性疾病密切相關[21]。在臺灣人群中已有研究顯示,MD-1基因多態性與遺傳哮喘易感性有一定關系[22]。在小鼠移植排斥反應中,MD-1基因表達水平與血清IL-10水平顯著相關[23]。

本研究分別在基因IL-10和MD-1上選取兩個SNP位點,在考慮過敏性鼻炎的基礎上探討其多態性與哮喘易感性的關聯。我們發現,IL-10基因的rs1800896位點（GG、GA、AA）和 MD-1基因的rs7740529位點（CC、CT、TT）的三種基因型頻率在哮喘患者和正常對照者均有差異,其多態性與廣州地區人群的哮喘易感性相關,其中雜合型（GA或CT）是保護基因型,OR值分別為0.033（95%CI:0.017～0.065,P＜0.001）和 0.369（95%CI:0.225～0.606,P＜0.001）,且有無過敏性鼻炎對其影響不大。而IL-10基因的 rs3024492位點和 MD-1基因的rs2233128位點的多態性與哮喘發病風險無相關性。推測IL-10和MD-1基因的多態性可能通過影響其后續的轉錄和翻譯而改變哮喘的易感性。而在基因型方面,可能哮喘和過敏性鼻炎的易感基因或位點各有特異性,可分別加以分析研究。

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[收稿2010-07-15 修回2010-08-19]

（編輯 許四平）

Association of single nucleotide polym orphisms in IL-10 and MD-1 genesw ith susceptibility of asthma

SUNMin-Ying,LIFen-Xia,YANGXue-Xi,LIMing.InstituteofAntibodyEngineering,SchoolofBiotechnology,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

Objective:To investigate the association of single nucleotide polymorphisms in IL-10（rs1800896,rs3024492）and MD-1（rs7740529,rs2233128）geneswith asthma susceptibility and the involvementof allergic rhinitiswith the disease.Methods:The four single nucleotide polymorphisms（rs1800896,rs3024492,rs7740529 and rs2233128）were genotyped via Sequenom MassARRAY○Rsystem in 141 asthmatic patients and 145 normal individuals as control.The asthmatic patients combinedwith allergic rhinitis or notwere comparedwith controls,respectively.Thegenotype frequencieswereanalyzed by Chi-square test in all groups.Unconditional logistic regression analysis,adjusted forage and sex,was used to calculateodds ratio（OR）and 95%confidence interval（95%CI）in order to analyze the associations between the suscep tibility of asthma and genotypes and also the influence of allergic rhinitis.Results:（1）The frequencies of genotypes GG,GA and AA of rs1800896 in asthma,asthma combinedwith allergic rhinitis and asthmawithoutallergic rhinitiswereallsignificantly different from that in controls（P＜0.001）.There was no obviousdifferencebetween allergic rhinitis and non-allergic rhinitis.Comparedwith GG and AA genotypes,the relative risk of developing asthma in the carrier of GA was significantly lower（OR=0.033,95%CI:0.017～0.065）.（2）The frequencies of genotypes CC,CT and TT of rs7740529 in asthma,asthma combined w ith allergic rhinitis and asthmawithout allergic rhinitiswere all significantly different from that in controls（P≤0.005）.Therewas no obvious difference between allergic rhinitis and non-allergic rhinitis.Compared with CC and TT genotypes,CT form decreased the risk of developing asthma（OR=0.369,95%CI:0.225～0.606）.3.The other two SNPs,rs3024492（TA/AA）and rs2233128（AG/GG）had no statistical significancebetween cases and controls（P＞0.05）.Conclusion:The single nucleotide polymorphisms of rs1800896 in IL-10and rs7740529 inMD-1 are statistically relatedwith the susceptibility ofasthma.Heterogeneous genotypes are less likely related to developmentof asthma and allergic rhinitis isindependents of polymorphisms in IL-10 and MD-1 genotypes.

IL-10;MD-1;Asthma;Single nucleotide polymorphisms;Genetic susceptibility

R392.2

A

1000-484X（2010）12-1096-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.009

①本文為廣州市科技攻關計劃（2008A1-E4151）

②中山大學達安基因股份有限公司,廣州510000

孫敏英（1985年-）,女,在讀碩士,主要從事疾病易感基因多態性研究;

及指導教師:李 明（1959年-）,男,教授,博士生導師,主要從事腫瘤免疫學研究。