輔助性T細胞亞群在小鼠EAE模型視神經中的變化①

張榮偉 田阿勇 禹紅梅 陳 蕾 （中國醫科大學附屬第一醫院老年病干診科,沈陽 110001）

輔助性T細胞亞群在小鼠EAE模型視神經中的變化①

張榮偉 田阿勇②禹紅梅③陳 蕾④（中國醫科大學附屬第一醫院老年病干診科,沈陽 110001）

目的:探討輔助性T細胞亞群Th1、Th2、Th17及Treg在小鼠EAE模型視神經炎發病機制中的意義。方法:C57BL/6小鼠隨機分為佐劑對照組（n=16）、EAE模型組（n=48）,免疫后第11、15、19天分批處死小鼠,觀察視神經組織的病理改變。ELISA方法檢測視神經IFN-γ、IL-4、IL-17的蛋白含量;Real-time PCR方法檢測視神經組織IFN-γ、IL-4、IL-17和Foxp3的基因表達。結果:免疫后第11天IL-17的蛋白及mRNA的表達比正常對照組明顯增高（14.255±0.790 vs 10.615±0.664;0.798±0.137 vs 0.083±0.013,均P＜0.05）,免疫后第19天IFN-γ的蛋白及mRNA的表達比對照組明顯增高（21.060±1.821 vs 12.845±0.970;0.617±0.070 vs 0.089±0.014,均P＜0.05）,IL-4的蛋白及mRNA的表達與對照組比較減少（10.227±0.767 vs 14.258±0.885;0.089±0.014 vs 0.250±0.047,均P＜0.05）。Foxp3mRNA的表達由免疫后11天、15天至19天與對照組比較均明顯減少（1.068±0.121,0.495±0.064,0.605±0.021 vs 3.087±0.194,P＜0.01）。結論:EAE小鼠視神經Foxp3和Treg表達減少可能為視神經炎發生發展的重要因素;IL-17在EAE小鼠視神經炎的早期階段介導炎癥損傷,IFN-γ在發病的高峰期加重了EAE小鼠視神經的炎癥損傷。

EAE;視神經;白介素17;干擾素γ、白介素4;叉頭蛋白3

①本文為遼寧省教育廳資助項目（2009A733）

②中國醫科大學附屬第一醫院麻醉科,沈陽110001

③中國醫科大學附屬第一醫院神經內科,沈陽110001

④中國醫科大學附屬第一醫院眼科,沈陽110001

視神經炎（Optic neuritis,ON）是累及視神經的急 性或亞急性炎癥,是神經眼科臨床最常見的疾病之一,西方國家文獻報道原發性或特發性脫髓鞘性視神經炎（Idiopathic demyelinatingoptic neuritis,IDON）是臨床最為常見的類型,該類型的視神經炎和多發性硬化（Multiple sclerosis,MS）的發病密切相關,二者有共同的病理改變[1,2]。流行病學研究表明70%的MS病人存在視神經炎,10%～20%的MS病人臨床首發癥狀為視神經炎,而且具有很高的轉化為MS的風險[3-5]。對視神經炎的早期識別與干預具有重要意義。從現有資料看,國內外脫髓鞘性視神經炎的分子免疫學研究并不多見,CD4+T輔助細胞（Th）是重要的免疫調節細胞,根據其分泌的細胞因子不同,分為Th1、Th2細胞亞型,Th1細胞主要分泌IFN-γ、TNF-α等細胞因子,具有促炎癥反應作用;Th2細胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子,具有抗炎作用[6]。最近研究發現一類不同于Th1和Th2的細胞亞群,它們不表達IL-4或IFN-γ,卻高水平分泌IL-17,被命名為Th17細胞,Th17細胞被證實能通過分泌炎癥介質IL-17誘導嚴重的自身免疫反應[7]。調節性T細胞（CD4+CD25+regulatory T cell,Treg）,約占外周CD4+T細胞的5%～10%,具有很強的免疫抑制能力[8]。叉頭蛋白3（forkhead/winged helix transcription factorp3,Foxp3）是FOX蛋白家族成員之一,主要表達于CD4+CD25+調節性T細胞,是Treg的特異性標志,調節 Treg發育和發揮功能的重要開關[9]。在EAE/MS發病機制的研究中,以往學者們更關注于腦與脊髓的病變,而缺乏對視神經病變的研究,尤其對輔助性T細胞亞群在小鼠EAE模型視神經中的變化報道很少。本研究通過ELISA、熒光定量PCR技術檢測Th1、Th2、Th17細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17以及Foxp3在視神經組織的蛋白及基因表達,旨在探討小鼠EAE模型視神經的免疫環境變化,研究輔助性T細胞亞群Th1、Th2、Th17和Treg在發病機制中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 健康6～8周齡的雌性野生型C57BL/6小鼠（SPF15）共 64只,體重16～18克,購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司,許可證號:SOXK（滬）2007-0005;MOG35-55多肽MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK由西安美聯多肽合成有限公司合成,合成純度HPLC＞99%;結核桿菌凍干粉、百日咳菌液（北京生物制品研究所）;完全弗氏佐劑（Sigma公司）;細胞因子ELISA試劑盒（北京博奧森公司）;逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司）;Real time PCR試劑盒（TaKaRa公司）;H-600型透射電鏡（日本）;Olympus BX51熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;ABI 7500 PCR儀（美國ABI公司）;

1.2 方法 動物購進后適應性喂養2周,隨機分為佐劑對照組（簡稱C）,模型組（簡稱M）,其中模型組又分為免疫后11天、免疫后15天和免疫后19天3個時間點,分別簡稱M11、M 15、M19,每組16只動物。

1.2.1 EAE模型制備 取MOG35-55 10 mg溶于2.5ml生理鹽水,取TB 17.5mg溶于2.5m l CFA（TB 1mg/m l）,充分乳化制備抗原乳劑（MOG 200μg/m l,TB 4mg/ml）。二組小鼠分別于背部脊柱中線兩側各選二個進針點皮下注射相應抗原,0.2 m l/只,以生理鹽水為對照,記免疫當天為0天,第0、2天予模型組腹腔注射百日咳菌液0.1ml（含百日咳桿菌109個）,對照組予等量生理鹽水。免疫后第7天以相同抗原乳劑重復免疫。

1.2.2 行為學觀察 小鼠經MOG免疫后,每日由觀察者按EAE癥狀評分標準對小鼠進行功能評分,直至MOG免疫后19天。評分標準[11]:0分:無任何臨床癥狀;1分:尾部張力消失,可見輕度步態笨拙;2分:雙后肢無力,被動翻身后可以恢復;3分:雙后肢癱瘓,被動翻身后不能恢復,但給予刺激后可以挪動;4分:雙后肢癱瘓,前肢癱瘓或肌力減弱伴尿便失禁;5分:瀕死狀態或死亡。癥狀介于兩者標準之間者以±0.5計。

1.2.3 標本收集及形態學觀察 分別于免疫后11天、15天、19天分批處死各組小鼠,快取雙側視神經,低溫勻漿后取上清,用于ELISA檢測;2.5%戊二醛固定后,常規方法制備電鏡切片;預冷PBS清洗后,置于DEPC處理過的凍存管中,投入液氮罐,4小時后轉入-70℃冰箱凍存備用。

1.2.4 IL-17、IL-4、IFN-γ細胞因子的ELISA 檢測采用ELISA雙抗體夾心ABC法,加入酶標板檢測。檢測程序按照試劑盒說明書進行。洗板后加入TBM顯色,置反應板于酶標儀上讀取OD值,制備標準曲線,求出小鼠視神經組織中IL-17、IFN-γ、IL-4蛋白的含量。

1.2.5 PCR實驗 （1）RNA提取及逆轉錄反應:采用Trizol法抽提各組視神經總RNA,將經過稀釋后的RNA樣本進行逆轉錄,反應體系如下:5×Buffer 2 μl,RTEnzymeMix Ⅰ 0.5 μl,OligodT（50Um）0.5μl,Total RNA（1 μg/μl）1.0,Random 6mers（100Um）0.5 μl,RNase Free dH2O up to 20μl,反應條件:37℃15分鐘,85℃5秒。（2）Real-time PCR:引物委托TaKaRa公司合成（見表1）,按照說明書用蒸餾水配成0.2 μmol/L濃度,將制備好的cDNA進行PCR擴增,擴增體系如下:SYBR-green（2×）10μl,PCR Forward Primer（10 Um）0.4 μl,PCR Reverse Primer（10 Um）0.4 μl,ROX Reference DyeII（50×）0.4μl,預變性95℃10秒檢測關;變性95℃5秒檢測關;退火 60℃34秒檢測關;延伸72℃45秒檢測開;變性、退火和延伸重復45個循環。以標準品梯度的測量結果繪制標準曲線,以計算各樣品所測基因的含量,各樣品目的基因的含量除以其管家基因的含量,即得到樣品校正后的基因相對含量。實驗引物見表1。

表1 各細胞因子基因的引物序列Tab.1 Cytokine prem ier sets for Real-time PCR

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0軟件包統計,計量資料用±s,采用雙尾t檢驗,P＜0.05有統計學差異。

2 結果

2.1 EAE小鼠行為學變化 免疫后14天左右,小鼠出現運動功能障礙,評分開始上升,發病后表現為慢性進展型,臨床神經功能評分見圖1。

2.2 視神經超微結構 電鏡所見正常視神經纖維較細,髓鞘密度較為均勻（圖2A）。免疫后第11天,少部分有髓神經軸索破壞,個別軸索內線粒體輕度腫脹;髓鞘不規則扭曲,板層結構消失（圖2B）。免疫后第15天,大部分有髓神經軸索破壞,神經纖維髓鞘明顯水腫,不規則增厚或板層狀結構排列疏松（圖2C）。免疫后第19天,絕大多數視神經均有較明顯的病變,表現為不同程度脫髓鞘:髓鞘板層狀分離、剝脫,軸突軸膜與髓鞘間有間隙形成,軸突髓鞘部分向內向外突起,或板層分離范圍擴大,夾雜著髓鞘半環形套疊、軸索水腫,電子密度低,細胞器消失,軸突呈空泡樣和均質狀,微管消失,甚至可見髓鞘塌陷（圖2D）。

2.3 EAE小鼠視神經IL-17、IL-4、IFN-γ蛋白含量的變化 IL-17蛋白含量檢測顯示:與對照組比較,M11組含量明顯增加（P＜0.05）,M 15組含量仍有增加（P＜0.01）,M 19組與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）;IFN-γ蛋白含量檢測顯示:與對照組比較,M 15組含量增加（P＜0.01）,M19組顯著增加（P＜0.01）,M11組與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）;IL-4蛋白含量檢測顯示:與對照組比較,M 19組減少（P＜0.01）,M 11、M 15組蛋白含量無明顯變化（P＞0.05）。細胞因子蛋白的表達趨勢如圖3所示。

圖1 EAE小鼠神經功能評分變化Fig.1 The clinical score of EAE mice

圖2 EAE小鼠視神經超微結構Fig.2 Ultra structure in the optic nerve of EAE m ice

圖3 EAE小鼠視神經IL-17、IFN-γ、IL-4蛋白的表達Fig.3 Expression of IL-17,IFN-γ,IL-4 proteins in the optic nerve of EAEm ice

圖4 細胞因子及其轉錄因子Real-time PCR的融解曲線Fig.4 Melt curve of IL-17,IFN-γ,IL-4 and Foxp3 mRNA of Real-time PCR

圖5 EAE 小鼠視神經 IL-17、IFN-γ、IL-4、Foxp3mRNA的時程表達Fig.5 Expression of IL-17,IFN-γ,IL-4,Foxp3 mRNA in the optic nerve

2.4 IL-17、Foxp3、IL-4 、IFN-γmRNA 在 EAE 小鼠視神經的表達 結果如圖4所示,融解曲線呈單峰,說明PCR反應特異性很好,生成單一產物。細胞因子mRNA的表達與其蛋白的表達規律一致,與對照組比較,M11組、M 15組視神經IL-17 mRNA的表達增加（分別P＜0.01,P＜0.05）,M19組表達逐漸下降（P＞0.05）;M15組視神經IFN-γmRNA表達增多,（P＜0.05）,M 19組表達最明顯（P＜0.01）;Foxp3 mRNA在 M11、M15、M19組表達均明顯減少（P＜0.01）;IL-4mRNA在M 19組表達下降,與對照組比較有統計學差異（P＜0.05）。細胞因子mRNA的表達趨勢如圖5所示。

3 討論

多年來關于視神經炎的發病機制缺乏深入系統的研究,原發性或IDON是臨床最為常見的類型,該類型的視神經炎和MS的發病密切相關,二者有共同的病理改變。在眾多有關MS的發病機制的學說中,具有更為充分的證據且廣為多數學者接受的理論是T淋巴細胞（Th0細胞）向致炎性的Th1細胞類型分化,致使Th1和Th2細胞（抗炎性Th細胞類型）平衡失調進而導致一系列炎癥細胞因子和化學因子釋放,從而引發中樞炎癥[12-13]。然而近來研究發現一種主要由活化的T細胞產生的具有較強致炎性的細胞因子IL-17能啟動和刺激多種細胞產生多種致炎性細胞因子和化學因子等,導致炎癥產生[14-16]。缺失Th17細胞能防止或減輕自身免疫性腦脊髓炎（EAE）等自身免疫病的發病[17]。此外,研究表明CD4+CD25+調節性T細胞在維持外周免疫耐受中起重要作用,其數量減少或功能缺失可導致自身免疫性疾病的發生。然而目前對于不同的輔助性T細胞亞群及其細胞因子在EAE小鼠視神經的表達規律缺乏深入系統的研究,本文對此作一初步探討,對于發病機制的認識及有效的干預具有重要意義。

本研究對上述CD4+T輔助細胞特異性細胞因子的蛋白及mRNA表達的研究發現小鼠致敏早期,即發病前出現IL-17的轉錄及翻譯高峰,開始發病后明顯下降,而IFN-γ在發病前表達較少,開始發病時表達增加,發病高峰時表達明顯增加,研究結果提示Th17細胞在EAE小鼠早期視神經炎的發病中發揮重要作用,而Th1細胞在延長或促進后期組織炎癥反應方面發揮主導作用。與Korn等[18]的研究結果類似,他們對EAE小鼠局部組織檢測到的炎癥介質的動態分析發現,IL-17出現高峰的時間早于IFN-γ,而且IFN-γ在IL-17消失后仍維持了很長的時間。IFN-γ的分泌滯后于IL-17的分泌提示Th1及Th17的分化表達具有階段性。

本文對Treg及Th2細胞因子及轉錄因子的研究發現,在小鼠致敏早期,即發病前出現Foxp3 mRNA表達的減少,且持續至發病的高峰期,而IL-4 mRNA表達只在發病高峰時出現輕微的減少,提示二者可能在疾病的不同時期發揮作用。Venken等[19]在一項對復發-緩解型多發性硬化和繼發進展型多發性硬化患者的研究中發現:兩組患者的CD4+CD25+T細胞均沒有明顯的數量和表型異常,繼發進展型多發性硬化患者CD4+CD25+T細胞上Foxp3表達水平和對INF-γ產生的抑制功能也是正常的,而RR-MS患者CD4+CD25+T細胞Foxp3表達減少,對CD4+CD25+T細胞增殖和INF-γ產生的抑制功能下降。證明了CD4+CD25+T細胞的抑制活性與疾病持續時間的關聯性,CD4+CD25+T細胞的功能在疾病早期更易受影響。研究證明Foxp3 mRNA與Treg細胞的表達頻率一致[20,21],因此本研究通過對Foxp3mRNA檢測,結果提示Treg在EAE小鼠視神經的早期分化或功能受到抑制。

總之,Foxp3和Treg表達減少,其抑制功能下降,使 Th17、Th1、Th2 細胞的分化和增殖異常 ,表現為視神經Th細胞在發病的早期階段優先向Th17亞群分化,在發病的高峰期優先向Th1亞群分化,分泌大量的 IL-17、IFN-γ、TNF-α等促炎細胞因子,而具有抗炎作用的Th2類細胞因子IL-4的基因表達量在發病的早期階段無明顯變化,在發病高峰期則出現輕微的減少,致使促炎和抗炎力量失衡,這是EAE小鼠視神經炎發生發展的重要因素。檢測病程不同階段IL-17、IFN-γ、Foxp3基因表達將可能作為該病的臨床診斷手段,而應用藥物或其他手段調節Th17/Treg、Th1/Th2亞群保持平衡,抑制促炎細胞因子分泌,將對該病的臨床防治具有重要作用。

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[收稿2010-06-25 修回2010-09-08]

（編輯 倪 鵬）

Alteration of T helper cell subsets in the optic nerve of experimental autoimmune encephalomyelitis

ZHANGRong-Wei,TIANA-Yong,YUHong-Mei,CHENLei.DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospitalof ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China

Objective:To detect protein and gene expression of interleukin-17（IL-17）,interferon-gamma（IFN-γ）,interleukin-4（IL-4）and forkhead/winged helix transcription factor p3（Foxp3）in optic nerve and further to explore the role of T helper cell subsets such as Th1,Th2,Th17,Treg in the pathogenesis of optic neuritis of experimentalautoimmune encephalomyelitis（EAE）.Methods:Mice in C57BL/6 background were randomly divided into control group and EAE group,at the day 11,15 and 19 post-immunization,optic nerveswere dissected for morphological study,to detect IL-17,IFN-γ,IL-4.Protein analysiswas done by Enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA）.Quantitative realtime polymerase chain reaction（PCR）was used formeasuring the gene expression of IL-17,IFN-γ,IL-4 and Foxp3.Results:The concentrations of IL-17 protein in theoptic nervewere significantup-regulated at11 days post-immunization,and sowere IFN-γprotein concentrations in 19 days.Concentrations of IL-4 protein in the optic nerve declinesslightly in19 days（P＜0.05,respectively）.ThemRNA expression of IL-17,IFN-γand IL-4 was consistentwith their protein expression（P＜0.05,respectively）.Foxp3 mRNA transcription was down-regulated from 11 days to 19 days post-immunization（P＜0.01,respectively）.Conclusion:Decreased expression of Foxp3mRNA and Treg in optic nervemay p lay a key role in developmentof optic neuritis.IL-17maymediate inflammatory pathogenicity at the early stage of optic neuritis,and IFN-γ may aggravate inflammatory injury during the peak stage of optic neuritis.

EAE;Optic nerve;IL-17;IFN-γ;IL-4;Foxp3

R741

A

1000-484X（2010）12-1101-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.010

張榮偉（1971年-）,女,博士,副教授,主要從事神經免疫方面的研究,E-mail:zhangrongwei916@sina.com。