抗體膜片法檢測乳腺癌患者血清C-erbB-2蛋白及其方法學評價①

于秀艷 曾常茜 劉曉峰 （吉林省腫瘤醫院,長春 130012）

抗體膜片法檢測乳腺癌患者血清C-erbB-2蛋白及其方法學評價①

于秀艷 曾常茜②劉曉峰 （吉林省腫瘤醫院,長春 130012）

目的:建立血清C-erbB-2蛋白的抗體膜片檢測方法,并進行方法學評價。方法:抗體膜片法檢測血清C-erbB-2蛋白,免疫組化方法檢測乳腺組織C-erbB-2蛋白。結果:30例乳腺癌、26例乳腺增生、30例正常對照組血清中C-erbB-2蛋白陽性率分別為40.0%、7.7%和6.7%,三組相比較有顯著差異（P＜0.05）;乳腺癌組織C-erbB-2蛋白陽性和陰性者其血清C-erbB-2蛋白陽性率分別為91.67%和11.11%,血清與乳腺組織C-erbB-2蛋白表達具有相關性（P＜0.01）;抗體膜片法檢測血清C-erbB-2蛋白的靈敏度、特異度和準確度分別為40.0%、92.8%和74.4%。結論:抗體膜片法檢測血清C-erbB-2蛋白與乳腺癌病理學診斷符合率高,且方法簡便易行,臨床具有實用價值。

C-erbB-2蛋白;乳腺癌;乳腺增生;抗體膜片法

C-erbB-2蛋白是癌基因C-erbB-2編碼的跨膜糖蛋白受體,分子量為185 kD,因此又稱p185蛋白。C-erbB-2蛋白具有酪氨酸激酶活性,被異常激活后發生自身磷酸化,并磷酸化其他底物,引起下游的信號轉導,最終導致細胞的增殖乃至癌變。自從文獻報道C-erbB-2擴增和/或過度表達與乳腺癌發生、發展及預后的關系后,引起了人們對C-erbB-2及其表達產物研究的關注。伴隨著C-erbB-2蛋白功能的發揮,受體的細胞外區域釋放入血,血清C-erbB-2蛋白水平對于判斷乳腺癌的發生、發展、預后及復發具有重要意義[1-4]。本實驗采用抗體膜片檢測血清C-erbB-2癌蛋白,旨在為乳腺癌的診斷提供特異、敏感、實用的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 乳腺癌患者術前血清及組織30例（經病理確診）,由吉林省腫瘤醫院提供,患者均為女性,年齡 24～75歲,其中浸潤性導管癌17例,浸潤性小葉癌10例,導管原位癌1例,小葉原位癌1例,乳頭狀癌1例。乳腺增生患者術前血清及組織26例（經病理確診）,由北華大學醫學院附屬醫院提供,患者均為女性,年齡23～50歲。正常血清30份,由北華大學醫學院附屬醫院提供,均為女性,年齡25～46歲。

1.1.2 試劑 C-erbB-2蛋白單克隆抗體（A18、A21）均為中國科技大學生命學院劉兢教授惠贈;乳腺癌細胞珠MCF-7由吉林省腫瘤研究所提供;C-erbB-2蛋白陽性抗原為SKBR-3細胞裂解液,購自美國Neomarkers公司;NC膜為丹麥NUNC公司產品;辣根過氧化物酶標記鏈親合素（SA-HRP）購自北京中山生物技術有限公司;超敏SP試劑盒、C-erbB-2單克隆抗體、DAB、C-erbB-2免疫組化陽性對照片、多聚-L-賴氨酸均購自福州邁新生物技術開發公司。

1.2 方法

1.2.1 C-erbB-2單克隆抗體A21的生物素標記（Bio-A21）及鑒定參照文獻[5]方法進行。

1.2.2 抗體膜片法檢測血清C-erbB-2蛋白 用C-erbB-2單克隆抗體（A18）溶液（20μg/m l）點樣5μl,待膜干燥后,用PBST洗膜5次。加1%BSA溶液37℃封閉30分鐘,用PBST洗膜5次。點加待測血清5μl,同時設C-erbB-2蛋白陽性和陰性對照,37℃孵育40分鐘,PBST洗膜5次。點加生物素標記的C-erbB-2蛋白單克隆抗體（Bio-A21）（1∶500）5μl,37℃孵育30分鐘,PBST洗膜5次。點加2μg/ml SA-HRP 5μl,37℃孵育30分鐘,PBST洗膜5次。點加DAB溶液5μl,37℃反應15分鐘,斑點出現后取出。用冰醋酸終止反應。

1.2.3 免疫組化方法檢測組織C-erbB-2蛋白表達采用SA-生物素-HRP復合物法（SP法）。按照SP免疫組化試劑盒說明書操作,其中鼠抗人C-erbB-2單克隆抗體稀釋度為1∶200,按美國食品和藥品管理局（FDA）推薦的Herlep Test評分標準判定結果。

1.2.4 ELISA方法檢測血清C-erbB-2蛋白 參考文獻[5]的方法。

1.3 統計學分析 采用 χ2檢驗,以P＜0.01為差異有顯著意義,以P＞0.05為差異無顯著意義。

1.4 方法學評價 以病理診斷作為乳腺癌診斷的金標準,對血清C-erbB-2蛋白鑒別診斷乳腺癌作方法學評價,計算敏感度、特異度、準確度。

2 結果

2.1 抗體膜片法和ELISA法檢測血清C-erbB-2蛋白結果 抗體膜片法檢測血清C-erbB-2蛋白結果見圖1,30例乳腺癌血清中,C-erbB-2蛋白12例陽性,18例陰性,陽性率為40.0%。26例乳腺增生血清中,C-erbB-2蛋白2例陽性,24例陰性,陽性率為7.7%。30例正常對照血清中,C-erbB-2蛋白2例陽性,28例陰性,陽性率為6.7%。經χ2檢驗,乳腺癌組血清C-erbB-2蛋白與乳腺增生、正常對照組相比較有顯著差異（P＜0.05）。

上述血清標本同時用ELISA法檢測血清C-erbB-2基因蛋白,結果30例乳腺癌血清中,C-erbB-2蛋白13例陽性,18例陰性,陽性率為43.3%。26例乳腺增生血清中,C-erbB-2蛋白3例陽性,23例陰性,陽性率為11.5%。30例正常對照血清中,C-erbB-2蛋白2例陽性,28例陰性,陽性率為6.7%。經 χ2檢驗,乳腺癌組血清C-erbB-2蛋白與乳腺增生、正常對照組相比較有顯著差異（P＜0.05）。

抗體膜片法與ELISA法檢測血清C-erbB-2基因蛋白的結果經統計學處理,二者無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 乳腺組織C-erbB-2蛋白表達結果 30例乳腺癌組織中,C-erbB-2蛋白12例陽性,18例陰性,陽性率為40%。26例乳腺增生組織未發現C-erbB-2蛋白的表達。經χ2檢驗,乳腺癌組織C-erbB-2蛋白的表達與乳腺增生組織相比較有顯著差異（P＜0.05）。

2.3 血清C-erbB-2蛋白與乳腺組織C-erbB-2蛋白表達相關性結果 30例乳腺癌組織中,12例C-erbB-2蛋白陽性中有11例血清C-erbB-2蛋白升高,18例C-erbB-2蛋白陰性中有2例血清C-erbB-2蛋白升高。經 χ2檢驗,血清C-erbB-2蛋白與乳腺組織C-erbB-2蛋白表達比較P＜0.01,說明血清C-erbB-2蛋白與乳腺組織C-erbB-2蛋白表達存在相關性。

圖1 血清C-erbB-2蛋白檢測結果Fig.1 The results of seral C-erbB-2 protein

表1 血清C-erbB-2蛋白診斷乳腺癌的方法學評價Tab.1 Themethologicalevaluation for seral C-erbB-2 protein in breast cancer patients

2.4 方法學評價結果 以病理診斷作為乳腺癌診斷的金標準,對血清C-erbB-2蛋白鑒別診斷乳腺癌作方法學評價。30例乳腺癌患者中12例C-erbB-2蛋白升高,26例乳腺增生患者中2例C-erbB-2蛋白升高,30例正常對照中2例C-erbB-2蛋白升高（表1）。經計算,靈敏度=12/30×100%=40.0%,特異度=52/56×100%=92.8%,準確度=64/86×100%=74.4%。

3 討論

乳腺增生與乳腺癌是臨床上常見的乳腺疾病,目前臨床最常用的鑒別方法是病理學診斷,不僅取材不便,還會給乳良增生患者造成不必要的損傷和痛苦。因此,尋找一種準確、敏感的生物學指標和檢測方法具有重要意義。

Lanrent發現C-erbB-2基因蛋白分子的細胞部分可以從乳腺癌細胞脫落并分泌到血清中,利用C-erbB-2蛋白胞外部分的單克隆抗體建立了ELISA方法檢測血清中C-erbB-2基因蛋白,也有學者用單克隆抗體6G10、SV-2-61、A18和A21等作為包被抗體和酶標抗體建立EIA檢測C-erbB-2基因蛋白[5-7]。本實驗建立了血清C-erbB-2蛋白的抗體膜片法,并對血清C-erbB-2蛋白與乳腺組織C-erbB-2蛋白表達的相關性進行分析,發現血清C-erbB-2蛋白與組織C-erbB-2蛋白表達水平存在相關性,與ELISA法無顯著差異,說明該方法可靠性好。以病理診斷為金標準,該抗體膜片法檢測血清C-erbB-2蛋白的靈敏度為40.0%,特異度為92.8%,準確度為 74.4%,說明該方法與臨床病理學診斷方法符合率較高。此外,該抗體膜片法克服了免疫組化方法檢測組織C-erbB-2蛋白的取材不便,與ELISA相比操作簡便易行,結果易攜帶和保存,因此臨床實用性較強。本研究還有待于增加檢測例數,為盡早在臨床上應用積累更多的資料。

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[收稿2010-03-08 修回2010-08-25]

（編輯 許四平）

Methological evaluation for seral C-erbB-2 protein in breast cancer patientsw ith the assay of antibodymembrane technique

YUXiu-Yan,ZENGChang-Qian,LIUXiao-Feng.CancerHospitalofJilinProvince,Changchun130012,China

Objective:To establish and evaluate for seral C-erbB-2 protein in breast cancer patients with antibody membrane technique.Methods:SeralC-erbB-2 protein was detected with antibodymembrane technique.The expression of C-erbB-2 protein in breast tissue was detectedwith immunohistochemical technique.Results:The positive rates of C-erbB-2 protein in sera of 30 breast cancer,26 breast proliferation patients and 30 normal controlswere40.0%,7.7%and 6.7%respectively.There was obvious difference in seral C-erbB-2 protein in breast cancer patients comparedwith those in breastproliferation patients and normal control（P＜0.05）.The positive rate of seral C-erbB-2 protein in C-erbB-2 positive breast tissue and C-erbB-2 negative tissuewere 91.67%and 11.11%respectively.There was a correlation between seral C-erbB-2 protein and expression of C-erbB-prote in breast tissue（P＜0.01）.The sensitivity,specificity and accuracy of seral C-erbB-2 protein breast cancerwere 40.0%,92.8%and 74.4%respectively.Conclusion:The antibodymembrane technique for seral C-erbB-2 protein accordswith pathologic diagnosis highly in dignosing breast cancer.In addition,themethod is easy and practical clinically.

C-erbB-2 protein;Breast cancer;Breastproliferation;Antibodymembrane technique

R446.61

A

1000-484X（2010）12-1130-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.017

①本文為長春市科技發展計劃項目（No.03-205544）

②大連大學遼寧省生物有機重點實驗室,大連116622

于秀艷（1968年-）,女,主任技師,主要從事腫瘤免疫學研究,E-mail:yuxiuyan1968@sohu.com;

及指導教師:曾常茜（1964年-）,女,教授,研究生導師,主要從事腫瘤免疫學研究,E-mail:zengchangqian@163.com。

·臨床免疫學·