抗人DR5功能性單克隆抗體誘導Jurkat細胞凋亡的線粒體途徑的分子機制①

杜耀武 柴立輝 黃紅瑩 白慧玲 趙粵萍 馬遠方

（河南大學免疫學研究所河南大學醫(yī)學院河南大學天然藥物與免疫工程省級重點實驗室,開封 475001）

抗人DR5功能性單克隆抗體誘導Jurkat細胞凋亡的線粒體途徑的分子機制①

杜耀武 柴立輝 黃紅瑩 白慧玲 趙粵萍 馬遠方

（河南大學免疫學研究所河南大學醫(yī)學院河南大學天然藥物與免疫工程省級重點實驗室,開封 475001）

目的:探討抗人死亡受體5（DR5）功能性單克隆抗體（mDRA-6）對Jurkat細胞誘導凋亡的線粒體途徑的分子機制。方法:MTT法檢測單克隆抗體（mDRA-6）對Jurkat細胞生長抑制作用的劑量-效果及時間-效果關(guān)系;JC-1單染流式細胞術(shù)定量分析技術(shù)對凋亡的Jurkat細胞線粒體膜電位的變化進行分析;免疫印跡技術(shù)檢測凋亡細胞的Caspase-8、3、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cyto c等凋亡相關(guān)蛋白的表達情況。結(jié)果:mDRA-6對Jurkat細胞抑制具有明顯劑量-效果和時間-效果關(guān)系;流式細胞儀檢測顯示,2.0μg/m l濃度的mDRA-6作用15、30、60和120分鐘時,Jurkat細胞線粒體膜電位改變率分別為 20.14%、19.34%、21.11%、30.90%,呈逐漸增高趨勢。免疫印跡技術(shù)檢測顯示,mDRA-6作用后,Jurkat細胞Caspase-8、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cyto c等表達活性增加,并且Cyto c在線粒體內(nèi)為遞減而在胞漿呈遞增的表達現(xiàn)象。結(jié)論:mDRA-6通過激活外源性膜受體,繼而啟動細胞線粒體途徑導致Jurkat細胞凋亡。本研究為mDRA-6對白血病治療奠定實驗基礎(chǔ)。

死亡受體5;單克隆抗體;Jurkat細胞;細胞凋亡

1995年Wiley等[1]報道,腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體（Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRA IL）可與腫瘤細胞膜相應(yīng)的死亡受體（Death receptor）DR4和/或DR5結(jié)合,誘導細胞凋亡。自此,對TRAIL及其DR4/DR5的研究一直備受關(guān)注,針對DR4及DR5的功能性單抗HGS-ETR1（Mapatumumab）和HGS-ETR2（Lexatumumab）等正在進行臨床一期或二期實驗研究。Hotte等以不同劑量的Mapatumumab對41例實體惡性腫瘤患者（其中結(jié)腸癌10例、卵巢癌 9例、宮頸癌5例、乳腺癌 3例、肺癌4例等）進行治療結(jié)果表明,12位（29.3%）患者的治療有效、病情穩(wěn)定[2];Plummer等以不同劑量Lexatumumab對37例實體惡性腫瘤患者進行治療后,13位（35.1%）患者的治療結(jié)果較好[3]。我國鄭德先教授研制的抗DR5功能性單克隆抗體AD5-10,也正在進行抗腫瘤的體內(nèi)外實驗研究[4]。

本實驗室以可溶性人DR5（rhDR5）胞外段蛋白對BALB/c小鼠進行免疫獲得了抗人DR5單克隆抗體,被命名為mDRA-6[5],此抗體可誘導Jurkat細胞及其它腫瘤細胞凋亡[6-8],并初步探明該抗體誘導Jurkat細胞凋亡的分子機制與膜受體途徑凋亡有關(guān)[8]。本研究仍然以TRA IL敏感的Jurkat細胞株為靶細胞,探討線粒體凋亡途徑的蛋白分子機制在DRA-6誘導Jurkat細胞凋亡中意義,為mDRA-6的臨床試驗進一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 抗體和細胞系 抗人DR5單克隆抗體mDRA-6為本實驗室制備[5];山羊抗人Caspase-8、9 IgG多克隆抗體及兔抗人Caspase-3 IgG單克隆抗體購于R&D公司;山羊抗人Bid（tbid）、Cyto c、Actin多克隆抗體,山羊抗人 BCl-2、Bax單克隆抗體購自Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊、山羊抗兔等IgG（H+L）購自北京中杉金橋公司。Jurkat細胞為TRAIL敏感株,由美國賓夕法尼亞大學醫(yī)學院病理與實驗醫(yī)學系陳有海教授饋贈,培養(yǎng)于2mmol/L L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉、10mmol/LHEPES、1mmol/L丙酮酸鈉、10%FBS、100 U/ml青霉素和100μg/m l鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,在 37℃、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng),實驗時取對數(shù)生長期的細胞。

1.2 主要材料與試劑 RPMI 1640、胎牛血清、四氮唑藍（MTT）購自GIBCO公司;rhTRAIL、DMSO購自Sigma公司;細胞線粒體分離及膜電位檢測試劑盒（JC-1）、Western blot試劑盒及IP細胞裂解液購自Beyotime公司;ECL顯影試劑盒購自Santa Cruz公司;流式細胞儀（FACSCalibur）為BD公司產(chǎn)品;垂直電泳儀及電轉(zhuǎn)裝置為Thermo EC公司產(chǎn)品;凝膠圖像分析儀（Alphalmager2200）為A lpha Inntech公司產(chǎn)品;數(shù)碼相機為Nikon公司產(chǎn)品。

1.3 mDRA-6對Jurkat細胞毒作用檢測 將密度為2.0×105m l-1的Jurkat細胞加于96孔平底型細胞培養(yǎng)板,100μl/孔,培養(yǎng)8小時作對細胞增殖作用的劑量-效果的檢測。加mDRA-6液100μl,使第1孔的抗體濃度為5.0μg/ml,然后倍比稀釋依次至第2、第3……第10孔,第11孔為不加mDRA-6的陰性對照,第12孔為不加細胞的空白對照;以rhTRAIL作為對照;每個濃度做3個復孔。置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育12小時,1 000 r/min離心5分鐘,吸出150μl上清,加入新培養(yǎng)液130μl/孔,加MTT（5.0 mg/m l）20μl/孔,繼續(xù)孵育4小時。離心后小心移棄上清。加DMSO,150μl/孔,避光振蕩混和10分鐘,全自動酶標儀測OD570值。

將相同密度的Jurkat細胞加于7塊96孔平底型細胞培養(yǎng)板內(nèi)作對細胞增殖作用的時間-效果的檢測,第1孔加入mERA-6為100μl,使其終濃度為0.5 μg/ml,第2孔為不加mDRA-6的陰性對照,第3孔為空白對照,每個濃度做3個復孔,以rhTRAIL作為對照 。繼續(xù)于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育,依次于 2、4、6、8、10、12小時取培養(yǎng)板,依照上述方法加入MTT及DMSO,全自動酶標儀測OD570值。

所有實驗重復3次,取平均值。計算Jurkat細胞死亡率和存活率。細胞死亡率（%）=100%-細胞存活率;細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白OD值）/（對照組OD值-空白OD值）×100%）。

1.4 線粒體膜電位（Mitochondrialmembrane potential,ΔΨm）檢測 將密度為 6.0×105m l-1的Jurkat細胞加于一組6孔板內(nèi),0.5 ml/孔,每孔加入mDRA-6,使其濃度為2.0 μg/m l,對照孔不加 。于15、30、60和120分鐘時依次收集每孔細胞,離心棄上清,加入0.5m l JC-1染色工作液,混勻后置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育20分鐘。離心后棄上清,加入緩沖液1ml混勻置冰上,以流式細胞技術(shù)檢測細胞線粒體膜電位的變化,用CellQuest軟件進行分析。

1.5 參與Jurkat細胞凋亡線粒體途徑的蛋白分子檢測 將密度為6.0×105ml-1的Jurkat細胞加于兩組6孔板內(nèi)0.5 ml/孔,加入mDRA-6,使其濃度為2.0μg/ml,對照孔不加。于 15、30、60和120分鐘時依次收集每孔細胞,離心棄上清,其中一組每管加入Western及IP細胞裂解液300μl充分混勻,置冰上30分鐘,10 000 r/m in低溫離心1分鐘,吸取上清;另一組以細胞線粒體分離試劑獲取每份樣品的線粒體裂解蛋白;BCA法測定每份樣品的蛋白總量,于12%～18%的SDS-PAGE進行電泳分離蛋白[9],隨后,將蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF膜上,加入Caspase-8、3、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cyto c 等一抗,與 PVDF 膜在室溫下孵育1小時,以PBST（含0.1%Tween 20的PBS）洗6次,10分鐘/次。加入二抗,室溫孵育1小時,以PBST洗去未結(jié)合抗體,以Kodak X-AR膠片記錄ECL法檢測結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析和t檢驗和方差分析,藥物作用Jurkat細胞的劑量-效果關(guān)系及時間-效果關(guān)系的分析作用采用直線回歸分析,實驗結(jié)果以±s表示,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 mDRA-6對Jurkat細胞的毒性作用[8]不同濃度的mDRA-6作用12小時后,Jurkat細胞的死亡率明顯增高,當濃度為4.9l～1 250 ng/ml時細胞的死亡與mDRA-6呈明顯的量-效關(guān)系,見圖1A。以0.5 μg/m l的 mDRA-6 作用 2、4、6、8、10、12 小時時 ,Jurkat細胞死亡率明顯增加,與mDRA-6作用時間呈明顯的時-效關(guān)系（r=0.928,P=0.008）;作為對照,相同濃度的rhTRAIL作用相同時間時,Jurkat細胞死亡率為 9.22%、17.39%、38.78%、47.18%、51.98%、58.08%,結(jié)果見圖1B。本檢測證明,相同濃度的mDRA-6及rhTRAIL作用于Jurkat細胞時,無論從量-效關(guān)系,還是從時-效關(guān)系上比較,mDRA-6誘導細胞凋亡的效果高于rhTRAIL。

2.2 mDRA-6對Jurkat細胞線粒體膜電位（ΔΨm）的影響經(jīng)JC-1單染后流式細胞學分析結(jié)果顯示,以2.0μg/m l的mDRA-6作用Jurkat細胞15、30分鐘和1、2小時后,Jurkat細胞線粒體膜電位下降率分別為20.14%、19.34%、21.11%、30.90%,提示 mDRA-6可以導致線粒體膜電位降低,見圖2。

2.3 mDRA-6對Jurkat細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 以2.0μg/m l的mDRA-6作用后,Western blot法檢測 Jurkat細胞Caspase-8、3、9 及 Bid 、Bax、Bcl-2、Cyto c表達結(jié)果顯示 ,Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9表達水平明顯增強;Bid酶原、Bcl-2隨作用時間的延長表達水平逐漸減少、而激活的tbid、Bax和Cyto c表達水平逐漸增加,而線粒體內(nèi)的Cyto c逐漸減少,證明Cyto c隨著作用時間的延長由線粒體基質(zhì)外溢至胞漿中,佐證了JC-1單染線粒體膜電位（ΔΨm）的變化,見圖3。

3 討論

自Wiley等報道TRAIL之后的十多年間,針對促凋亡受體激動劑（Proapoptotic receptor agonists,PARAs）的研究一直是方興未艾,目前文獻報道的針對DR4/DR5的功能性抗體約有8個[10],有的已經(jīng)用于臨床Ⅰ期試驗,并取得了一定的療效[2-4]。mDRA-6是本實驗室研制的針對人DR5的功能性單克隆抗體,與rhDR4、rhDcR1、rhDcR2和 rhFas等無交叉反應(yīng),能與腫瘤細胞膜表面的DR5結(jié)合誘導腫瘤細胞凋亡,其誘導凋亡作用可以被 rhDR5完全阻斷[5]。mDRA-6無需交聯(lián)即可誘導多種腫瘤細胞凋亡,并與化療藥物具有協(xié)同殺傷腫瘤細胞的作用[11,12]。

圖1 mDRA-6、rhTRAIL對Jurkat細胞死亡率Fig.1 The dose-dependence and time-dependence of Jurkat cell death treated bymDRA-6&rhTRAIL

圖2 mDRA-6誘導Jurkat細胞調(diào)亡的流式細胞儀分析結(jié)果Fig.2 Analysis Jurkat cellapoptosis treated bymDRA-6 with JC-1 stain by FCM

圖3 Western blot檢測mDRA-6作用 Jurkat細胞相關(guān)凋亡信號的結(jié)果Fig.3 Activation of caspase cascade and apoptotic proteins were tested by Western b lot

我們的前期實驗結(jié)果顯示,mDRA-6可誘導Jurkat細胞凋亡[8],可使 Jurkat細胞 Caspase-8、3、9 均被激活,Caspase-8抑制劑對Jurkat細胞凋亡的抑制作用遠高于Caspase-3、9抑制劑的作用[8]。初步證實,mDRA-6對Jurkat細胞的凋亡作用與其它已知的DR5的功能性單抗AD5-10、TRA-8等具有相似的膜受體凋亡機制[4,13]。本實驗在前期工作的基礎(chǔ)上,對分析了對Jurkat細胞線粒體膜電位改變的分析,免疫印跡顯示 Bid（tbid）、Bax、Bcl-2、Cyto c等與線粒體途徑凋亡相關(guān)的蛋白分子的變化情況。

線粒體膜電位（ΔΨm）的下降是細胞早期凋亡的一個標志。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時,JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物（J-aggregates）,產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時,JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中,此時JC-1為單體（monomer）,產(chǎn)生綠色熒光。所以,用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。當以2.0μg/ml的mDRA-6作用15分鐘、30分鐘、1小時、2小時后,Jurkat細胞線粒體膜電位下降率分別為20.14%、19.34%、21.11%、30.90%（見圖 2）,此結(jié)果與mDRA-6對Jurkat細胞毒性作用的量-效關(guān)系及時-效關(guān)系的結(jié)果分析不一致,遠低于相當劑量時Jurkat的細胞死亡率,提示mDRA-6在通過降低線粒體膜電位引起細胞凋亡的同時,還有其它誘導細胞凋亡的途徑[8]。

蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示,隨著mDRA-6的作用時間延長,Caspase-8、3、9和Bax活性片段表達均呈現(xiàn)漸進式增加,在120分鐘時活性片段表達最強。Bid（tbid）Bid酶原表達逐漸減少、而激活的tbid表達逐漸增加,對凋亡有抑制作用的Bcl-2表達逐漸減少、而對凋亡起促進作用的Bax卻表達逐漸增多;同時,Cyto c表達增加,在120分鐘時表達最強,而線粒體內(nèi)的Cyto c表達逐漸減少,在120分鐘處幾乎沒有表達,提示隨著mDRA-6對Jurkat細胞作用時間延長,Cyto c由線粒體基質(zhì)大量外溢至胞漿中,進而導致細胞的凋亡（見圖3）。

細胞凋亡主要通過兩種既獨立又彼此相關(guān)的信號傳導機制:一種是外源性的膜受體途徑,通過激活細胞膜表面的凋亡受體;另一種是內(nèi)源性的線粒體途徑,通過激活細胞內(nèi)的線粒體信號。這兩者匯集于效應(yīng)分子Caspases,協(xié)調(diào)引導細胞凋亡[14]。對由Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（Fas-associated death domain,FADD）及Caspase-8和/或Caspase-10啟動的腫瘤細胞凋亡機制的研究中,發(fā)現(xiàn)有兩種不同類型的凋亡機制在相應(yīng)的細胞中起重要作用。Ⅰ型細胞中Caspase-8和/或Caspase-10作用于Caspase-3的二聚體酶原結(jié)構(gòu)而引起Caspase-3活化[15],激活的Caspase-3消化分解包括ICAD（Inhibitorof Caspase-activated deoxyribonuclease）在內(nèi)的構(gòu)成細胞基本結(jié)構(gòu)的多種蛋白成分,而ICAD的破壞導致CAD的活化,后者引起細胞DNA降解,最終導致細胞凋亡[16]。Ⅱ型細胞中,可能因凋亡抑制蛋白XIAP（X-chromosome linked Inhibitory of Apoptosis Protein）的影響使Caspase-3不能被有效地激活、啟動凋亡進程,從而通過Caspase-8和/或Caspase-10啟動了BID（Bcl-2 inhibitory BH3-domain-containing protein,BID）激活為活性狀態(tài)的tbid[17],與Bax（Bcl-2-associated X protein）共同插入線粒體外膜層,使線粒體內(nèi)膜亦破壞崩解而引起Cyto c等外溢[18],再與Apaf-1（Apoptotic protease activating factor 1）、Pro-caspase-9和dATP形成一種被稱之為apoptosome的復合體,這種復合體二聚化再激活Caspase-9,進一步放大Caspase-3的激活而誘導腫瘤細胞的凋亡[19]。

本實驗結(jié)果提示,mDRA-6誘導的Jurkat細胞凋亡的過程中,通過線粒體途徑誘導細胞凋亡具有很重要的作用。mDRA-6首先作用于細胞膜表面的DR5,激活受體形成三聚體進而募集細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)接分子Pro-caspase-8,使后者進一步成為活化狀態(tài)的Caspase-8,通過外源性的膜受體凋亡途徑進一步激活下游的效應(yīng)分子Caspase-3、9,繼而作用于死亡底物發(fā)生凋亡。同時,活化的Caspase-8激活Bid形成有活性的tbid,在促進凋亡的Bax分子參與下,消減抗凋亡分子Bcl-2對線粒體膜的穩(wěn)定作用,破壞線粒體膜的完整性,引起線粒體膜電位下降,導致Cyto c由線粒體基質(zhì)外溢至胞漿中而促使細胞的凋亡。本研究及我們的前期工作提示,mDRA-6誘導Jurkat細胞凋亡的分子機制可能與mDRA-6首先激活外源性的膜受體途徑,繼而啟動細胞內(nèi)源性的線粒體途徑[8],通過細胞凋亡的兩種途徑導致Jurkat細胞凋亡的。詳細機制參見圖4。

mDRA-6誘導 Jurkat細胞凋亡過程中,有無JUK/P38/PARP途徑的參與,Smac/DIABLO 、P53、NF-κB等分子的表達如何仍不清楚,還需要進一步實驗。抗人DR5的功能性單克隆抗體mDRA-6是一種具有誘導腫瘤細胞凋亡活性的功能性抗體,將其人源化改造后可有效地用于抗腫瘤生物治療,可為TRAIL/DR5系統(tǒng)的抗腫瘤應(yīng)用提供一種新的生物治療制劑。

圖4 mDRA-6誘導Jurkat細胞凋亡的分子機制示意圖Fig.4 Themolecu lar mechanisms of mDRA-6 inducing apoptosis in Jurkat cells

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[收稿2009-06-07 修回2009-09-24]

（編輯 許四平）

Them itochondrial-dependentmolecular mechanisms for inducing apoptosis in Jurkat cellsby a novelagonistic anti-human DR5monoclonal antibody

DUYao-Wu,CHAILi-Hui,HUANGHong-Ying,BAIHui-Ling,ZHAOYue-Ping,MAYuan-Fang.InstituteforImmunologyofHenanUniversity,MedicalCollegeofHenanUniversity,TheKeyLaboratoryofNaturalDrug&ImmunologyEngineering,HenanUniversity,Kaifeng475001,China

Objective:To investigatemitochondrial-dependentmolecularmechanisms of a novel agonistic anti-human death receptor 5（DR5）monoclonal antibody（mDRA-6）inducing apoptosis in Jurkat cell.Methods:The dose-dependent and time-dependent cellgrow th suppression ofmDRA-6 in Jurkat cellswas determined by MTT assay.Themeasurement of them itochond rial transmembrane potential（ΔΨm）of Jurkat cellswasdetected by flow cytometrywith JC-1 single staining.Caspase-8,9 aswell as Bid,Bax,Bcl-2 and Cyto c of apoptotic Jurkat cells were analyzed byWestern blotaftermDRA-6 treatment.Results:ThemDRA-6 induced cellgrow th suppression and cytotoxicity in dose-dependentmanner and time-dependentmanner.AftermDRA-6 treatment at2.0μg/ml for15min,30min,60min and 120min,the change inΔΨm were 20.14%,19.34%,21.11%and 30.90%respectively by JC-1 single staining.Western blot revealed that the levelofactive fragmentsof Caspase-8,9 and Bid,Bax,Bcl-2 and Cyto c respectively,and the amountof Cyto cwasincreased in cytosol concomitantwith the related attenuation of Cyto c inmitochondria.Conclusion:Apoptotic pathway of Jurkat cells induced bymDRA-6 is initiated upon DR5 ligation tomDRA-6 and exogenic Caspase-dependent cell apoptotic cascades is activated,and endogenicmitochondrial-dependent cell apoptosis pathway is activated.mDRA-6may be ausefu lagent in investigating human leukemia therapy by using TRAIL/DR5.

Death recptor5;Monoclonal antibody;Jurkat cell;Apoptosis;Western blot

R392.11

A

1000-484X（2010）01-0003-05

①本文受國家863重大專項子課題（No.2006AA02A 254）及河南省杰出人才創(chuàng)新基金項目（No.074200510014）的資助

杜耀武（1971年-）,男,醫(yī)學碩士,副教授,主要從事腫瘤免疫學研究,E-mail:dyw711@henu.edu.cn;

及指導教師:馬遠方（1960年-）,男,醫(yī)學博士,教授,博士生導師,主要從事腫瘤免疫與抗體工程研究,E-mail:mayf@henu..edu.cn。