髓樣抑制細胞免疫抑制機理的研究①

萬 琳 胡 鑫 趙賢賢 李曉燕 李卓婭 尹丙姣

（華中科技大學同濟醫學院免疫學研究所,武漢 430030）

髓樣抑制細胞免疫抑制機理的研究①

萬 琳 胡 鑫 趙賢賢 李曉燕 李卓婭 尹丙姣

（華中科技大學同濟醫學院免疫學研究所,武漢 430030）

目的:研究荷瘤小鼠來源的髓樣抑制細胞（Myeloid derived suppressor cell,MDSC）在腫瘤免疫抑制中的作用機理。方法:用Percoll分離法從荷瘤小鼠的脾臟和骨髓中分離Gr-1+CD11b+MDSC;用流式細胞術檢測MDSC對T細胞增殖的抑制作用;分別用生化法和ELISA技術檢測MDSC體外培養上清中抑制性因子NO、ROS和IL-10、TGF-β的含量。結果:MDSC在荷瘤小鼠的脾臟和骨髓中聚集增多,且其在骨髓中所占的比例顯著高于脾臟;MDSC可以明顯抑制脾臟細胞的增殖,體外培養6小時的MDSC可以分泌大量NO、ROS和IL-10、TGF-β。結論:本實驗進一步證實MDSC可以通過分泌大量NO、ROS和IL-10、TGF-β抑制T細胞增殖。

髓樣抑制細胞;NO;ROS;IL-10;TGF-β

多年來對腫瘤疫苗的研究,雖然在動物實驗中取得了良好的效果,但是臨床效果欠佳[1],其重要原因是腫瘤抗原可以產生免疫逃避現象,抑制機體免疫功能[2-4]。人們對腫瘤免疫耐受機制進行了深入的探討和研究,發現在慢性炎癥的局部和腫瘤組織中聚集有大量的未成熟髓樣抑制細胞（Myeloid derived suppressor cells,MDSC）,該細胞是一群異質性細胞,它包括未成熟的巨噬細胞、樹突狀細胞和粒細胞等,其共同的表面標志為Gr-1+CD11b+,具有很強的免疫抑制作用,是引起腫瘤免疫逃逸的重要細胞群體[5-7]。目前研究證實,MDSC的免疫抑制作用與兩種精氨酸代謝酶密切相關:Ⅰ型精氨酸酶（arginase-1,ARN-1）和誘導性一氧化氮合酶（Inducible nitricoxide synthase,iNOS也稱NOS-2）[8-15]。同時MDSC能分泌免疫抑制因子,如集落刺激因子、TGF-β、IL-10等抑制T細胞分化[16-20]。本研究采用Percoll密度梯度離心法從荷瘤小鼠骨髓中分離MDSC,經流式細胞術鑒定此法分離的50%～60%Percoll界面之間的細胞中有80%為Gr-1+CD11b+MDSC,以此MDSC為對象,研究其對T細胞增殖的抑制作用及其機理,為腫瘤免疫逃逸機理及臨床抗腫瘤治療研究提供新的實驗手段和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞系與主要試劑

1.1.1 實驗動物 6～8周齡C57BL/6J小鼠（購自武漢大學醫學院實驗動物中心）。

1.1.2 細胞株 C57BL/6J小鼠肺癌細胞株LLC（Lewis Lung Cancer）（曹雪濤教授惠贈）。

1.1.3 主要試劑 DMEM、RPM I1640培養基（Gibco公司,美國）;小牛血清（杭州四季青生物工程公司）;Percoll（Amersham 公司,美國）;FITC-anti-Gr-1+、PE-anti-CD11b+、PE-anti-CD3 與 PE-anti-TNF-a（eBioscience公司,美國）;CFSE、乙酰肉豆蔻佛波酯PMA、離子霉素 Iono mycin（Sigma公司,美國）;mIL-10 ELISA試劑盒、mTGF-βELISA試劑盒（eBioscience公司,美國）;一氧化氮試劑盒、羥自由基檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）;其他生化試劑均為國產AR級。

1.2 荷瘤小鼠腫瘤模型構建及其脾臟和骨髓單個細胞懸液的制備 用1×PBS將處于對數生長期的LLC細胞調至密度為1×107個/ml,取0.1 ml細胞懸液皮下注射至C57BL/6J小鼠右腹背部,三周后（腫瘤長至直徑1～3厘米時）處死小鼠。取其脾臟,用磨砂玻片碾磨,然后取孔徑為200目尼龍膜過濾,1 000 r/min離心5分鐘,棄上清,加入2m l紅細胞裂解液,用吸管輕輕地吹打后靜置3分鐘,加入10%FCSRPMI1640培養基5m l終止紅細胞裂解反應,取尼龍膜過濾,離心洗細胞,用培養基調整細胞濃度,置冰上備用;同時分離小鼠的股骨和脛骨,用5 ml一次性注射器吸取1×PBS沖洗骨髓腔,經尼龍膜過濾、離心洗細胞后,用培養基調整細胞濃度,置冰上備用。

1.3 采用密度梯度離心法初步分離MDSC 文獻報道MDSC的密度約為1.069,其分離方法如下:預先用100%的Percoll溶液懸浮上述脾臟和骨髓細胞,將一吸管插至15m l的離心管中,沿吸管壁依次緩緩注入各 2 ml的 PBS、50%Percoll、60%Percoll、70%Percoll和100%Percoll溶液懸浮的上述脾臟或骨髓細胞,2 900 r/min離心30分鐘,收集第二層細胞懸液（50%和60%Percoll溶液之間）,用1×PBS洗細胞兩次后,調整細胞濃度2×107ml-1,置冰上備用。這層細胞約80%為CD11b+Gr-1+MDSC。

1.4 用流式細胞術檢測脾臟和骨髓中MDSC數量百分比 取1×106上述荷瘤小鼠脾臟、骨髓的細胞原液及經Percoll溶液分離后的MDSC,按照抗體說明書加入FITC antiGr-1和PE antiCD11b對細胞進行染色,同時設對照組,用流式細胞儀檢測CD11b+Gr-1+細胞的數量百分比。

1.5 采用CFSE遞減法檢測MDSC對T細胞增殖的抑制作用 CFSE是一種綠色熒光染料,可使細胞著色,并且隨著細胞的增殖,熒光逐漸減弱,直至消失。經過CFSE染色后的T細胞會隨著細胞增殖,熒光逐漸衰減,以此推測T細胞的增殖狀況。本實驗取正常6周齡的C57BL/6J小鼠的脾臟,按上述方法制備成5×107m l-1脾臟細胞懸液,取該細胞1m l與1m l 0.1%BSA的PBS和1μl CFSE（終濃度 5μg/m l）混勻,置37℃,5%CO2培養箱培養30分鐘后加入1m l小牛血清終止反應,再加入9m l無血清的RPMI1640混勻,1 000 r/min離心5分鐘,棄上清,然后取無血清的RPM I1640洗細胞兩次,最后用1ml 10%FSC RPMI1640培養基重懸細胞,調細胞密度至 2×107ml-1。

取上述經CFSE染色的脾臟細胞懸液和上述經Percoll溶液分離的MDSC各100μl（2×106）（1∶1）混合,并用100μl Ionomycin（終濃度10 ng/ml）和100μl PMA（終濃度10μg/ml）刺激其中T細胞增殖。同時設各種對照組:未加MDSC組、未加MDSC及Ionomycin和PMA組。各組最終用10%FCSRPM I1640培養基補足2ml終體積,置37℃,5%CO2培養箱培養5天,收集細胞至流式測定試管中,用PE antiCD3標記T細胞,用流式細胞儀檢測CD3+細胞即T細胞增殖指數。

1.6 采用生化方法檢測MDSC培養上清中NO、ROS的含量 分別采用硝酸還原酶-Griess試劑法和Fenton反應法檢測MDSC培養上清中NO和ROS含量。其操作按各自試劑盒說明書進行。取經Percoll溶液分離的正常小鼠和荷瘤小鼠來源的MDSC 2×106于0.5ml無血清培養基中,置37℃、5%CO2培養箱中培養6小時后,收集其細胞培養上清,其中,荷瘤小鼠來源的MDSC分別培養4、6、12、18、24小時后收集上清。

1.7 ELISA法檢測MDSC培養上清中IL-10、TGF-β的含量 采用ELISA檢測上述MDSC培養6小時后上清中IL-10、TGF-β的含量,其操作按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 MDSC在荷瘤小鼠骨髓和脾臟中聚集增多文獻報道在荷瘤小鼠和腫瘤病人的骨髓、脾臟中聚集有大量的MDSC。本實驗給6周齡C57BL/6J小鼠皮下接種1×106LLC三周后,用流式細胞儀檢測也發現其骨髓、脾臟中Gr-1+CD11b+細胞即MDSC較正常小鼠顯著增多,并且在骨髓中增加的幅度大于脾臟。具體結果如圖1、2和3所示。圖1顯示正常小鼠骨髓中MDSC約占23.3%,而荷瘤小鼠骨髓中MDSC明顯增多,約占62.5%（P＜0.01）,經Percoll分離純化后MDSC純度提高至79.5%。圖2顯示正常小鼠脾臟中MDSC約占22.53%;荷瘤小鼠脾臟中MDSC顯著增多,約占45.12%（P＜0.01）;經Percoll純化后可使MDSC純度提高至62.5%。

圖1 荷瘤小鼠和正常小鼠骨髓中MDSC數量的比較Fig.1 Comparison on the number of MDSC from tumorbearing and normalmouse

圖2 正常小鼠和荷瘤小鼠脾臟中MDSC數量的比較Fig.2 Comparison on the number of MDSC from spleen of tumor-bearing and normalmouse

將骨髓和脾臟中MDSC百分比進行統計分析后,結果如圖3所示,MDSC在荷瘤小鼠骨髓和脾臟中均聚集增多,且在骨髓MDSC聚集量比脾臟的多。

2.2 MDSC可以抑制T淋巴細胞增殖 檢測T淋巴細胞受抗原刺激后的活化和增殖,是判斷機體免疫狀況的一個重要指標。本實驗首先用CFSE標記脾臟細胞后,與骨髓來源的MDSC按1∶1混合培養,同時在該混合培養體系中加入Ionomycin和PMA作為T淋巴細胞的多克隆激活劑刺激T細胞增殖,以便觀察MDSC細胞對T細胞增殖的影響;培養5天后,用PE antiCD3單克隆抗體標記T細胞,用流式細胞儀檢測T細胞的增殖指數,結果如圖4所示:靜止T細胞的增值指數是1.07;在Ionomycin和PMA刺激下T細胞的增值指數增至5.68,而加入MDSC后,T細胞的增殖指數降為3.0（P＜0.01）,提示經percoll分離的骨髓來源的MDSC能顯著抑制T淋巴細胞增殖。2.3 MDSC能產生大量的NO和活性氧（Reactive oxygen species,ROS） 有文獻報道,MDSC可通過產生NO和ROS抑制機體抗腫瘤免疫[8-13],本實驗也比較了正常和荷瘤小鼠骨髓來源的MDSC產生NO和ROS的水平。首先觀察體外培養荷瘤小鼠來源的MDSC產生NO的動態變化,結果如圖5所示:荷瘤小鼠MDSC產生的NO在4小時即開始增高,6小時達高峰,經過幾個小時的平臺期,在18小時時開始逐漸下降,因此后續實驗中選擇6小時的時間點比較正常與荷瘤小鼠MDSC產生NO的水平,結果如圖6,荷瘤小鼠MDSC產生NO的量顯著高于正常小鼠來源的MDSC,分別為 264.9μmol/L和31.1 μmol/L（P＜0.01）,是正常小鼠MDSC產生NO的8.5倍。

圖3 正常小鼠和荷瘤小鼠脾臟和骨髓中MDSC數量的比較Fig.3 Comparison on the number of MDSC from bone marrow of tumor-bearing and normalmouse

圖4 MDSC抑制T淋巴細胞增殖Fig.4 MDSCs surp ress the proliferation of T lymphocytes

圖5 荷瘤小鼠MDSC體外產生NO的動態變化Fig.5 The level of NO quantity change rule in MDSC culture supernatants from tumor-bearingmouse

圖6 比較兩種來源的MDSC產生NO和ROS量Fig.6 Comparison on the quantity of NO and ROS from tumor-bearing and normalmouse

此外,我們同時觀察和比較了正常小鼠和荷瘤小鼠MDSC產生ROS的水平。結果如圖6所示,荷瘤小鼠來源的MDSC在體外培養6小時時ROS含量顯著高于正常小鼠來源的MDSC（P＜0.01）,約提高了1倍多。

2.4 MDSC表達IL-10、TGF-β抑制性細胞因子 為了進一步研究MDSC抑制機體抗腫瘤免疫的機制,本實驗采用ELISA的方法檢測了不同來源的MDSC在體外培養6小時后上清中IL-10、TGF-β的含量,結果發現來源于荷瘤小鼠MDSC分泌的IL-10顯著高于正常小鼠的MDSC（P＜0.01）,分別為337.5 pg/m l和196.4 pg/ml,而且,TGF-β的分泌也有相同的趨勢,荷瘤小鼠MDSC分泌的TGF-β顯著高于正常小鼠的MDSC（P＜0.01）,二者分別為25 072.25 pg/ml和16 083.615 pg/ml（圖7）;提示荷瘤小鼠MDSC很有可能通過分泌IL-10、TGF-β等抑制性細胞因子抑制機體的免疫功能。

圖7 比較兩種來源的MDSC產生IL-10和TGF-β的量Fig.7 Comparison on the quantity of IL-10 and TGF-βfrom tumor-bearing and norma lmouse

3 討論

大量的研究報道,慢性炎癥和腫瘤組織中聚集的MDSC具有很強的免疫抑制作用,是引起腫瘤免疫逃逸的重要細胞群體。其免疫抑制機制有:①大量產生誘導性一氧化氮合成酶和精氨酸酶,通過促進NO和活性氧產生而直接抑制T細胞功能[8-15];②其產生的精氨酸酶消耗精氨酸,導致TCR CD3ζ合成受阻,使T細胞信號轉導障礙[12-15];③MDSC一旦浸潤腫瘤組織即可分化為TAM和血管內皮細胞,抑制T細胞的抗腫瘤免疫功能[7]。④MDSC可分泌TGF-β、IL-10等抑制性細胞因子,誘導CD4+CD25+Foxp 3+調節性 T細胞（Treg）產生,抑制腫瘤免疫[16-20]。

本研究也進一步證實MDSC在荷瘤小鼠的脾臟和骨髓中聚集顯著增多,且其在骨髓中所占的比例及增高的幅度顯著高于脾臟;經Percoll純化的、骨髓來源的MDSC（取自50%～60%界面的細胞,其MDSC純度達80%）可以明顯抑制脾臟細胞中T淋巴細胞的增殖,體外培養6小時后可以分泌大量NO、ROS和IL-10、TGF-β。但MDSC的免疫抑制功能與其來源有關,往往只有從荷瘤小鼠和腫瘤患者體內分離到的MDSC才具有免疫抑制功能,而用同樣的方法從正常小鼠和人體內分離的MDSC不具有或僅有很低的免疫抑制功能[20],本實驗也得到同樣的結論,即荷瘤小鼠來源的MDSC的免疫抑制功能顯著高于正常小鼠來源的MDSC。

MDSC高表達精氨酸酶（ARN）和一氧化氮合酶（NOS）,兩者均參與了MDSC免疫抑制作用。其具體機制如下:腫瘤微環境中左旋精氨酸（L-Arg）減少,L-A rg通過兩種酶——ARN和NOS代謝:①ARN途徑:L-Arg在ARN的作用下生成鳥氨酸和尿素。②NOS途徑:L-Arg被NOS氧化,生成一氧化氮（NO）和瓜氨酸。進一步研究證實,L-Arg是CD8+T細胞生成CD3和CD8所必須的氨基酸,L-A rg缺乏可導致T細胞受體（TCR）CD3ζ鏈合成受阻和TCR信號轉導障礙。而CD3ζ鏈合成受阻又可通過反饋機制使細胞內ARN生成增多,故導致機體內L-Arg的耗竭[12,13,21-24]。

IL-10具有很強的免疫抑制作用,其參與MDSC的免疫功能的機制可能包括:①IL-10能夠誘導未成熟的輔助性T淋巴細胞（Th0）向Th2細胞分化,抑制Th1細胞的生成。Th2細胞產生的IL-4、IL-6、IL-10都可直接刺激腫瘤細胞生長,促進腫瘤細胞和MDSC產生更多的IL-10。②IL-10能抑制單核/巨噬細胞系統產生 IL-1、IL-12、TNF-α、GM-CSF,抑制T 細胞及NK 細胞產生TNF-β、IFN-γ,并促進單核/巨噬細胞系統、T細胞和NK細胞產生IL-10。③IL-10能抑制各種抗原遞呈細胞（APC）對抗原的趨化反應,并抑制APC膜上MHCⅠ、Ⅱ類分子及CD80、CD86等的表達,從而抑制了APC向T細胞遞呈抗原[16,20,21,25-31]。

另外,荷瘤小鼠來源的MDSC產生大量TGF-β參與MDSC的免疫功能的機制可能包括如下:①可以促使Th1/Th2平衡向Th2細胞方向偏移。②可以抑制CTL和NK細胞CD3中ζ鏈信號的傳遞,抑制ζ鏈及細胞質中蛋白酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的磷酸化,故抑制相應轉錄因子的活化。③TGF-β能夠抑制IFN-γ及MHC Ⅱ類分子合成[18,20]。

總之,本實驗進一步證實荷瘤小鼠的MDSC通過分泌大量NO、ROS和IL-10、TGF-β抑制機體抗腫瘤免疫,同時證明荷瘤小鼠骨髓細胞經Percoll分離后取其50%～60%界面的細胞可用于MDSC生物學功能的基礎研究,為研究腫瘤免疫逃逸機理及臨床抗腫瘤治療提供新的實驗手段和理論依據。

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[收稿2009-03-15 修回2009-06-05]

（編輯 倪 鵬）

Study on mechanismsof immune suppression mediated bymyeloid derived suppressor cells

WANLin,HUXin,ZHAOXian-Xian,LIXiao-Yan,LIZhuo-Ya,YINBing-Jiao.InstituteofImmunology,TongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

Objective:To study themechanisms of immune suppressionmediated by Gr-1+CD11b+myeloid derived suppressor cells（Gr-1+CD11b+MDSC）from tumor-bearingmice.Methods:Gr-1+CD11b+MDSC recruited into spleen and bonemarrow of tumor-bearing micewere purified by Percoll,and suppressionmediated byMDSC on T cell proliferation from sp leen of na?vemicewas detected by flow cytometry with CSFE and FITC-anti CD3 staining,and NO,ROS,IL-10 and TGF-βin the supernatantofMDSCwere detected by Griess and ELISA.Results:There weremuchmoreGr-1+CD11b+MDSCs in spleen and bonemarrow from tumor-bearingmouse than those of na?vemouse,and suppression on T cell proliferationmediated by MDSC from tumor bearingmouse was significantly increased,and there weremuchmore NO,ROS,IL-10 and TGF-βin the supernatant of these MDSC than that from na?vemouse.Conclusion:MDSC from tumor-bearingmice secreted high level of NO,ROS,IL-10 and TGF-βto induce immune suppression,and inhibite the proliferation of T cells.

MDSC;NO;ROS;IL-10;TGF-β

R392.111

A

1000-484X（2010）01-0017-06

①本文為國家自然科學基金資助項目（No.30771976）

萬 琳（1982年-）,女,在讀碩士,主要從事腫瘤免疫學研究,E-mail:wanlin811002@sina.com;

及指導教師:尹丙姣（1964年-）,女,教授,碩士生導師,主要從事腫瘤免疫學研究,E-mail:bingjiaoyin@gmail.com。