流感病毒H1N1和H5N1感染小鼠小膠質細胞與星形膠質細胞誘導趨化因子轉錄水平上調①

王革非 李衛中 張 衡 曾 俊 張丹桂 陳幼瑩 陳小璇 李康生

（汕頭大學醫學院微生物學與免疫學教研室 廣東高校免疫病理重點實驗室,汕頭 515041）

流感病毒H1N1和H5N1感染小鼠小膠質細胞與星形膠質細胞誘導趨化因子轉錄水平上調①

王革非 李衛中 張 衡 曾 俊 張丹桂 陳幼瑩 陳小璇 李康生

（汕頭大學醫學院微生物學與免疫學教研室 廣東高校免疫病理重點實驗室,汕頭 515041）

目的:探討膠質細胞感染流感病毒后的天然免疫反應,檢測流感病毒H1N1和H 5N1體外感染小鼠小膠質細胞和星形膠質細胞,是否會誘導膠質細胞趨化因子轉錄水平的變化及其規律。方法:從新生小鼠大腦皮質分離培養神經膠質細胞,并進一步純化小膠質細胞和星形膠質細胞,經純度鑒定后,用感染復數為2的流感病毒H1N1和H5N1進行體外感染,8小時后用免疫熒光檢測流感病毒核蛋白（NP）的表達,以確認感染細胞比例。在感染早期（6小時）和感染中期（24小時）分別提取細胞RNA,檢測趨化因子轉錄水平的變化。結果:分離得到小鼠的小膠質細胞和星形膠質細胞,病毒感染后超過95%的細胞可以被感染,感染后的小膠質細胞與星形膠質細胞的CCL-3、CCL-5、CXCL-2、CXCL-9和CXCL-10的轉錄水平發生不同程度的上調,其中CXCL-10的上調幅度最為明顯,禽流感病毒H5N1感染能誘導更強烈的上調反應。結論:流感病毒H1N1和H5N1感染小鼠小膠質細胞與星形膠質細胞,可誘導趨化因子轉錄水平上調。

小膠質細胞;星形膠質細胞;流感病毒;趨化因子

流感病毒的感染除能造成人呼吸系統疾病外,在部分感染人群中會出現中樞神經系統（Central nervous system,CNS）病變[1],即流感相關腦病/腦炎（Influenza associated encephalopathy or encephalitis）,是指在急性流感過程中伴隨中樞神經系統功能障礙的一種臨床綜合征,起病快速、病情兇險,主要的臨床表現為癲癇發作、意識消退、昏迷等,嚴重時引起神經后遺癥或死亡,如雷耶氏綜合征（Reye's syndrome）、出血性休克與腦病綜合征（Hemorrhagic shock and encephalopathy syndrome）和急性壞死性腦病（A-cute necrotizing encephalopathy）等[2-4]。在流感患者,尤其是兒童中,具有一定的發病率和死亡率[4]。流感病毒可通過被破壞的血腦屏障、嗅球-三叉神經節、內臟-神經途徑及其它可能途徑感染CNS[4],在流感相關腦病患者的腦脊液和腦組織中可以檢測到流感病毒RNA及相關抗原的存在[5,6]。但流感相關腦病的發病機制仍不明確。

在流感相關腦病病人的腦脊液中,發現促炎癥細胞因子的濃度升高[6-8]。在CNS中,神經膠質細胞,尤其是小膠質細胞和星形膠質細胞是細胞因子分泌的主要來源[9]。在流感病毒感染中,促炎癥細胞因子釋放的強度被認為與疾病的嚴重程度存在可能的正相關聯。中樞神經系統中細胞因子及趨化因子在免疫及神經內分泌網絡的連接和調節中起到十分重要的作用,促炎癥因子的過量釋放不僅造成神經元和膠質細胞的免疫損傷和凋亡,還會影響外周免疫并誘導全身性反應[10,11]。中樞神經系統受流感病毒感染后,膠質細胞過度釋放的促炎癥細胞因子,可能會誘導嚴重的中樞神經系統紊亂及全身性癥狀。

因此,研究流感病毒是否會誘導膠質細胞發生促炎癥細胞因子反應,明確促炎癥因子與趨化因子的類型,將有助于理解膠質細胞在流感病毒感染CNS時的功能和作用。我們前期實驗發現流感病毒感染膠質細胞可誘導 IL-1β、TNF-α和 IL-6的過度釋放[12],流感病毒H5N1在肺部誘發的細胞因子風暴中,除上述3種促炎癥因子外,IP-10、CCL-5等趨化因子的表達亦發生過度釋放[13-15],因此,本研究利用人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1感染膠質細胞,檢測是否出現趨化因子表達的上調,明確小膠質細胞和星形膠質細胞在流感病毒感染后,所發生的促炎癥因子反應中趨化因子類型與變化,為闡明流感相關腦病的發病機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 1至2日齡無特異病原（Specific pathogen free,SPF）的BALB/c小鼠由汕頭大學醫學院實驗動物中心提供。

1.2 流感病毒毒株 人A型流感病毒A/Shantou/169/06（H1N 1）分離于2006年汕頭大學醫學院第一附屬醫院兒科門診上呼吸道感染兒童[16]。禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/1/05（H5N1）分離于2005年廣東省。流感病毒在MDCK細胞和9～10日齡的雞胚進行初步增殖收獲病毒母液,經標準血清/血凝抑制實驗鑒定病毒亞型,病毒為本室保存。利用10%醛化的豚鼠紅細胞及雞紅細胞懸液,使用紅細胞吸附/洗脫以及超濾的方法對A型流感病毒A/Shantou/169/06（H1N1）和A/Chicken/Guangdong/1/05（H 5N1）進行純化[1-3]。經超濾離心管（M illipore）更換病毒緩沖體系后,-80℃保存,測定病毒滴度。

1.3 新生小鼠大腦皮層神經膠質細胞的培養 將1至2天新生小鼠大腦皮層組織取出,于DMEM/F12（1∶1,v/v）培養基中吹打分散后,用50μm濾器過濾得到細胞懸液。37℃放置30分鐘去除成纖維細胞。未貼壁細胞于37℃、5%CO2培養箱中培養。接種后第2天和第4天,棄去未貼壁的細胞,更換培養基。以后每5～7天更換一次培養基,至膠質細胞長成單層。

1.4 小鼠大腦皮層小膠質細胞與星形膠質細胞的分離 長成單層的膠質細胞0.05%胰酶37℃作用約10分鐘,將含有星形膠質細胞的胰酶液經終止、離心后培養。1天將細胞培養瓶固定于定軌搖床（上海智誠）中 37℃、200 r/min、振幅30 mm水平震蕩60分鐘,棄懸浮細胞,加入10%FBS的DMEM/F12培養基繼續培養1天后,按上述方法再次進行震蕩分離,得到純化后的星形膠質細胞。

長成單層的混合膠質細胞用0.1%胰酶37℃作用約15分鐘,鏡下觀察星形膠質細胞脫落后,棄去消化液,DMEM/F12清洗 2遍,加入胰酶消化液（0.25%trysin/0.02%EDTA）37℃作用5～10分鐘,得到小膠質細胞組分[6],經終止、離心后用10%FBS的DMEM/F12培養基培養。

分離后的小膠質細胞與星形膠質細胞,使用CD11b和膠質細胞纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）抗體進行免疫熒光法檢測純度。星形膠質細胞與小膠質細胞按每孔105個細胞接種12孔細胞培養板,用于后續實驗。

1.5 流感病毒感染神經膠質細胞 小鼠小膠質細胞和星形膠質細胞,用0.5ml含有2×105pfu流感病毒（H1N1和H5N1）的病毒液感染,感染復數（Multiplicity of infection,MOI）為2,37℃吸附1小時。吸附結束后,每孔加入1m l無血清DMEM/F12,37℃、5%CO2培養箱中培養。設立未感染孔為陰性對照。感染/刺激后6小時和24小時收集細胞,經PBS清洗后,用于RNA提取、逆轉錄及半定量PCR。

1.6 流感病毒核蛋白的免疫熒光檢測 為檢測流感病毒是否感染在小膠質細胞和星形膠質細胞,將感染8小時的膠質細胞,經固定與穿孔后,利用抗甲型流感病毒NP單克隆抗體（Vector Lab）為一抗,Cy3標記的抗小鼠IgG抗體（碧云天生物技術研究所）為二抗,對流感病毒核蛋白NP免疫熒光檢測。

1.7 膠質細胞RNA的提取及反轉錄 感染后的膠質細胞,使用RNeasy Minikit（Qiagen）試劑盒提取細胞的RNA,實驗方法參照Qiagen公司說明書。取1μg的 RNA,用SuperScript Ⅲ RNaseH-Reverse Transcriptase（Invitrogen）和隨機六堿基引物（hexaprimers,大連寶生物工程公司）反轉錄,反應體系為20μl。25℃反應5分鐘、50℃繼續反應60分鐘完成反轉錄,70℃15分鐘滅活反轉錄酶,得到反轉錄后的cDNA用于半定量PCR反應。

1.8 小鼠膠質細胞感染流感病毒后炎癥相關因子的半定量PCR檢測 cDNA用特異性引物進行半定量PCR,用于檢測小膠質細胞及星形膠質細胞在流感病毒感染后,趨化分子（CCL-2、CCL-3、CCL-5、CXCL-2、CXCL-9、CXCL-10）的表達變化情況。引物見表1,退火溫度根據引物堿基長度組成及預實驗結果為56℃～60℃,反應循環次數根據預實驗結果為32～40循環。PCR使用預混的PCR反應液（MasterM ix,北京天根）,反應體系25μl,其中,Premix Taq Mixture 12.5 μl、引物 12 μl（0.5 μmol/L）、cDNA 0.5 μl,按照產品說明書和引物參數進行PCR反應。PCR產物經電泳、拍照后,用BandScan4.3分析條帶的灰度值。各個基因的PCR產物灰度值同樣品內參GAPDH基因PCR產物灰度值進行均一化,以未感染對照樣品相應基因PCR產物均一化后的比值為100%,計算感染樣品基因轉錄變化。

2 結果

2.1 小鼠膠質細胞的分離與培養 圖1所示,小鼠原代培養的混合膠質細胞生長約20～25天,細胞長成單層,即可用于分離小膠質細胞和星形膠質細胞。利用不同濃度胰酶的分步消化可得到純化的小膠質細胞,通過低濃度胰酶分離和搖床震蕩培養可得到純化的星形膠質細胞。小膠質細胞選用細胞特異性表面標志CD11b進行免疫熒光檢測,星形膠質細胞用GFAP為細胞特異性標志進行檢測,細胞均出現特異性的熒光染色,相應的對照細胞或一抗缺失樣品則沒有熒光出現,小膠質細胞和星形膠質細胞的純度均超過95%。

表1 趨化因子PCR引物列表Tab.1 The detail information of the primers of chemokines

圖1 混合膠質、小膠質細胞和星形膠質細胞的分離與培養（40×）Fig.1 Isolation and culture ofm ixed glial cells,m icroglia,and astrocytes（40×）

圖2 膠質細胞感染流感病毒 H1N1和H5N1 8小時后的NP蛋白染色（200×）Fig.2 NP immunofluorescence staining of H1N1 and H5N1 infected microglia and astrocy tes at 8 h p.i.（200×）

2.2 流感病毒感染膠質細胞的NP蛋白檢測 小膠質細胞和星形膠質細胞經流感病毒H 1N1和H5N1吸附后繼續培養8小時,對甲型流感病毒的NP蛋白進行免疫熒光染色,如圖2所示,在H1N1和H5N1吸附培養的小膠質細胞和星形膠質細胞的細胞核中,均出現陽性的熒光信號,表明流感病毒在吸附細胞后,能夠進入細胞進行相應的生物合成和復制,表達流感病毒復制所需的NP蛋白。當流感病毒H1N1和H5N1在MOI為2時,首輪培養即可以導致超過95%以上的細胞感染流感病毒。

2.3 流感病毒感染膠質細胞誘導趨化因子轉錄水平上調 使用半定量PCR檢測小膠質細胞及星形膠質細胞在流感病毒感染后,趨化因子CCL-3、CCL-5、CXCL-2、CXCL-9、CXCL-10的表達變化情況。根據預實驗的結果,對引物進行了優化,選取了擴增效率高、特異性強的引物用于該實驗,確定了相應的引物最適退火溫度,同時選擇PCR產物的對數增長階段后期的循環數為最適循環次數,對上述基因的表達變化進行檢測（圖3）。

對PCR產物電泳照片進行灰度分析,各樣本以32個循環的內參基因GAPDH的灰度值進行均一化處理,然后各基因以對照組細胞的表達量為參照（100%）進行比值處理,基因的表達變化結果見圖4。結果表明,小膠質細胞和星形膠質細胞在流感病毒感染后6小時和24小時,趨化因子的表達發生不同程度的上調。圖3和圖4的結果提示,流感病毒不同亞型在同等感染條件下,H5N1比H1N1能夠誘導膠質細胞更強烈的炎癥因子反應,趨化因子的表達上調幅度更大。

圖3 膠質細胞感染流感病毒H1N1和H5N1后趨化因子電泳圖Fig.3 The PCR products electrophoresis photo of chemokines of in fluenza H 1N1 and H5N1 infected glial cells

圖4 膠質細胞感染流感病毒H1N1和H5N1后趨化因子的轉錄水平變化Fig.4 The transcrip t levels of chemokines of influenza H1N1 and H5N1 in fected glial cells

3 討論

盡管流感病毒能夠感染中樞神經系統,流感病毒相關的腦病與腦炎綜合征的發病機制仍然不明確。流感病毒相關腦病與腦炎綜合征患者的腦脊液和血漿中,促炎癥細胞因子水平異常升高[6-8]。異常升高的促炎癥細胞因子常常引發局部或系統性的免疫病理損傷[10,11]。可以推測在流感病毒相關腦病與腦炎綜合征的發生和發展中,不僅存在著病毒的直接破壞作用,同時可能伴隨著炎癥細胞因子大量釋放而造成的免疫病理損傷。

流感病毒,尤其是H 5N1毒株,在體外可誘導多種細胞釋放高濃度的促炎癥細胞因子,在體內的局部器官和血漿中也發現存在著大量促炎癥細胞因子的積累,大量釋放和積累的促炎癥因子,如TNF-α、IL-1β等,通過細胞因子的級聯反應（Cytokine cascade）,產生以細胞因子分泌失調和過度釋放為表現的細胞因子風暴效應（Cytokine storm）,從而可能引發相應的免疫病理損傷,這種以促炎癥細胞因子過度釋放導致的細胞因子風暴被認為是高致病性H5N1引起嚴重疾病的可能原因[13-15]。

小膠質細胞和星形膠質細胞在中樞神經系統的免疫應答過程起關鍵作用,同時也是中樞神經系統中細胞因子的主要分泌來源[9]。因此,探索小膠質細胞和星形膠質細胞在流感病毒感染后所發生的變化及免疫反應,對理解流感病毒相關的腦病與腦炎綜合征的發病機制有一定的幫助。本研究以小鼠大腦的小膠質細胞和星形膠質細胞為靶細胞,用人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1感染細胞,檢測細胞趨化因子轉錄表達水平。

對人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1吸附后8小時的膠質細胞進行A型流感病毒NP蛋白免疫熒光染色,發現在細胞核內存在大量表達的NP蛋白,表明H1N1和H 5N1病毒可以感染星形膠質細胞和小膠質細胞,并在細胞中進行了病毒復制相關的蛋白表達。實驗結果究表明,流感病毒感染后趨化因子 CCL-3、CCL-5、CXCL-2 、CXCL-3、CXCL-10 等的表達出現上調。其中,禽流感病毒H5N1感染的神經膠質細胞,其促炎癥細胞因子及趨化因子的表達上調水平高于H 1N1感染的細胞。

流感病毒感染所誘導神經膠質細胞的炎癥因子反應中,除了促炎癥因子上調外[12],本研究亦發現趨化因子的轉錄水平發生上調。促炎癥因子和趨化因子的上調,能夠導致其它炎癥細胞趨化因子、粘附分子、急性時相蛋白和組織蛋白酶等的合成,當其表達上調過于強烈時,則引發細胞因子風暴。趨化因子可以募集并活化巨噬細胞、單核細胞等免疫細胞（如 CCL-3/MIP1α,CXCL-2/MIP2,CXCL-9/M IG 等）、激活細胞抗病毒免疫（如CCL-5/RANTES,CXCL-10/IP10等）,從而抵御病毒攻擊,但趨化因子表達的異常上升會使免疫細胞過度集中及活化而導致免疫病理損傷。膠質細胞感染H5N1病毒后,促炎癥細胞因子以及趨化因子的水平發生了強烈的上調。在流感病毒感染中,促炎癥細胞因子釋放的強度被認為與疾病的嚴重程度存在可能的正相關聯[15]。細胞因子及趨化因子在免疫及神經內分泌網絡的連接和調節中起到十分重要的作用[10,11]。中樞神經系統中,促炎癥因子的過量釋放不僅造成神經元和膠質細胞的免疫病理損傷和凋亡,還會影響外周免疫并誘導系統性反應[6,20]。因此,中樞神經系統受H5N1感染可以誘導比人流感病毒感染更嚴重的中樞神經系統紊亂及系統性疾病。

促炎癥細胞因子與趨化因子的過度釋放,可能參與了對神經膠質細胞的直接破壞作用和對腦部組織的間接免疫病理損傷作用,這些可能是誘導及加重流感相關腦病和腦炎的重要因素。另一方面,應用具有多向性生物活性的免疫抑制因子IL-10以及其它促炎癥因子抑制劑,如IL-1受體拮抗肽（IL-1 receptor antagonist,IL-1ra）、TNF拮抗肽等,來平衡或抑制嚴重的促炎癥反應,為緩解或減輕細胞因子風暴可能造成的繼發性免疫病理損傷提供思路。

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[收稿2009-05-26 修回2009-08-19]

（編輯 張曉舟）

Upregulation of chemokine transcriptive levels induced by avian H 5N1 and human H1N1 in fluenza viruses inmousem icroglia and astrocytes

WANGGe-Fei,LIWei-Zhong,ZHANGHeng,ZENGJun,ZHANGDan-Gui,CHENYou-Ying,CHENXiao-Xuan,LI Kang-Sheng.DepartmentofMicrobiologyandImmunology,theKeyImmunopathologyLaboratoryofGuangdongProvince,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China

Objective:To investigate the innate immune response of influenza virus-infected glial cells,the transcription levels in chemokines inmousemicroglia and astrocyteswere detected which pre-infected by human H1N1 or avian H5N1 influenza viruses.Methods:The glial cells isolated from neonatalm ice cerebral cortex were cultured and furthermicrogliaand astrocyteswere purified.The primarymouse microglia and astrocyteswere infected in vitroby H1N1or H5N1 influenza virusesinamultip licity of infection（MOI）2.Eighthours post infection,the influenza virus nucleoprotein（NP）was detected by immunofluorescence to identify the proportion of infected cells.The cellular RNA were extracted at 6 h and 24 h to detect the transcriptional levelof chemokines by semi-quantitative RT-PCR.Results:More than 95%of the microglia and astrocyteswhich isolated from micewere infected.The transcription levels of CCL-3,CCL-5,CXCL-2,CXCL-9and CXCL-10 from infectedm icroglia and astrocyteswere upregulated.Futhermore,themRNA levelof CXCL-10 increasedmuchmore.In addition,avian H5N1 influenza virus could inducemore strongerup regu lation of those chemokines than human H1N1 did.Conclusion:Themousemicroglia and astrocyteswhich are infected by H1N1 influenza virus orH5N1 influenza virus could induce upregulation of transcription levelof chemokines.

Microglia;Astrocyte;Influenza virus;Chemokine

R392.6 R373.1

A

1000-484X（2010）01-0029-06

①本文受國家自然科學基金項目（30771988,30972766）、廣東省自然科學基金（9451503102003499,8151503102000022）和廣東高校優秀青年創新人才培育項目（LYM08056）資助

王革非（1978年-）,男,博士,講師,主要從事神經免疫與抗感染免疫研究,E-mail:gfwangcn@gmail.com;

及指導教師:李康生（1953年-）,男,教授,博士生導師,主要從事神經免疫與抗感染免疫研究,E-mail:ksli@stu.edu.cn。