人Izumo蛋白的二級結構及B細胞抗原表位預測①

楊 霞 劉凱軍 申子剛 何海洋 張 記 張巧玉 吳玉章 李晉濤

（第三軍醫大學全軍免疫學研究所,重慶 400038）

人Izumo蛋白的二級結構及B細胞抗原表位預測①

楊 霞 劉凱軍②申子剛 何海洋 張 記 張巧玉③吳玉章 李晉濤

（第三軍醫大學全軍免疫學研究所,重慶 400038）

目的:預測人Izumo蛋白的二級結構及B細胞抗原表位。方法:以人Izumo基因序列為基礎,按Chou-Fasman和Gamier-Robson方法預測其編碼蛋白的二級結構,采用Karplus-Schulz方法預測Izumo蛋白骨架區的柔韌性;按Kyte-Doolittle方法預測其親水性、Emini方法預測蛋白質表面可能性及Jameson-Wolf方法預測抗原性指數。結果:Chou-Fasman及Gamier-Robson兩種方法預測的結果均表明,Izumo蛋白含較多的α螺旋,蛋白第 6～ 17、30～ 40、88～ 99、103～ 120、153～ 160、173～ 188、249～ 260、283～297、334～338和339～346區段可能是α螺旋中心,第21～25、198～200、245～248和320～323區段可能是β折疊中心。用Kyte-Doolittle、Emini和Jameson-Wolf方法分別對Izumo蛋白B細胞抗原表位進行預測結果表明,蛋白質第36～42、62～66、94～99、118～ 122、129～ 132、151～ 154、161～ 164、173～ 177、205～ 208、212～ 216、256～ 265、271～ 276、283～ 288、314～ 318 和 336～ 350區段附近很可能為B細胞表位優勢區域。結論:該研究結果有助于確定Izumo蛋白的B細胞優勢表位及發揮免疫避孕的活性部位。

人Izumo蛋白;二級結構;B細胞優勢表位

Izumo蛋白特異表達于精子表面,定位于精子頭部[1]。在新鮮精子的表面檢測不到Izumo蛋白的表達,發生頂體反應以后在小鼠和人類精子的表面能檢測到Izumo蛋白的表達并且精子可育[2]。正常情況下,只有發生了頂體反應的精子才能被Izumo抗體著色[3]。推測Izumo蛋白可能不是定位在新鮮精子質膜上而是隱藏在質膜下,頂體反應發生以后才暴露出來。同源重組技術敲除的Izumo-/-雌鼠生育正常;Izumo-/-雄鼠生長健康,交配、射精行為正常;精子發育正常,運動力及遷移能力沒有影響,但精子不育。進一步的研究表明Izumo-/-雄鼠精子能與去除卵透明帶的卵子質膜結合,但不能和卵子融合[2]。

目前的研究結果表明,Izumo蛋白可望成為新型男性免疫避孕的靶抗原。本研究在已獲得Izumo氨基酸序列的基礎上,運用計算機技術和分子生物學軟件對Izumo蛋白質二級結構和B細胞抗原表位進行分析和預測,為確定Izumo蛋白B細胞優勢表位及發揮免疫避孕的活性部位和制備Izumo蛋白單克隆抗體提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 Izumo氨基酸序列選擇 選取來自人源睪丸組織的Izumo蛋白（由基因序列推導）共有350個氨基酸殘基,相對分子質量為39 kD,等電點為6.35。檢索自NCBI數據庫,基因登錄號為BC034769,具體序列見圖1。

1.2 Izumo蛋白的二級結構及柔性區域的預測 應用DNAStar Protean軟件提供的模塊進行,采用Chou-Fasman方法通過序列氨基酸殘基的晶體結構來預測二級結構;采用Gamier-Robson方法通過計算特定氨基酸殘基在特定結構內部的可能性來分析預測Izumo蛋白的二級結構。采用Karplus-Schulz方法對Izumo蛋白骨架區的柔韌性進行分析。

1.3 Izumo蛋白的B細胞表位預測 應用DNAStar Protean軟件進行,采用Kyte-Doolittle方法的氨基酸親水性標準,預測其親水性;采用Emini方法預測蛋白質的表面可能性;以及采用Jameson-Wolf方法預測抗原性指數。

2 結果

2.1 Izumo蛋白二級結構預測 用Chou-Fasman方法預測Izumo蛋白二級結構,發現其形成許多α螺旋,位置分別在第 6～17、30～ 40、44～ 73、79～ 83、88～ 99、103～120、131～ 134、153～ 161、173～ 188、215～221、254～262、283～298、334～338和 339～ 346區段。預測結果也顯示在分布區段上α螺旋與β折疊交叉分布,在各β折疊單元之間存在豐富的轉角結構（圖2）。采用Gamier-Robson法預測Izumo蛋白二級結構,同樣發現其形成大量α螺旋,位置分別在第3～21、25～ 85、87～ 100、101～ 132、141～ 150、153～160、169～190、207～ 219、225 ～ 228、230 ～ 233、249～260、271～276、283～297、299～320和 332～ 350區段。用該方法預測的β折疊結構較Chou-Fasman方法預測的數量要少。在各α螺旋單元之間存在長短不一的轉角和無規則卷曲結構（圖3）。

綜合Chou-Fasman和Gamier-Robson兩種方法預測的結果,Izumo蛋白含較多的α螺旋,該蛋白第6～17、30～ 40、88 ～ 99、103～ 120、153 ～ 160、173～188、249～260、283～ 297、334～338和339～ 346區段可能是α螺旋中心。Izumo蛋白第21～25、198～200、245～248和320～323區段可能是β折疊中心。

圖1 人Izumo氨基酸序列Fig.1 Am ino acid sequence of Izumo in Homosapiens

圖2 Chou-Fasman方法預測Izumo蛋白二級結構Fig.2 The secondary structure of Izumo protein predicted by Chou-Fasmanmethods

圖3 Gamier-Robson方法預測Izumo蛋白二級結構Fig.3 The secondary structure of Izumo protein predicted by Gam ier-Robson methods

2.2 Izumo蛋白骨架區的柔性分析 Izumo蛋白骨架區含有較多的柔性區域,主要集中在蛋白第33～42、62～ 66、79 ～ 87、92～ 105、118～ 122、136 ～ 138、152～ 155、166～ 169、173 ～175、189～ 195、203～ 221、223～ 230、236～ 243、258 ～266、268～ 280、281～ 287、322～326和330～348區域（圖4）。這些區域可能具有一定的柔韌性,發生扭曲、折疊的幾率較高,形成表位的可能性較大,容易與抗體進行嵌合。由于Izumo是一種具有組織特異性表達的分子,在精卵結合發生頂體反應的時候特異表達,抗Izumo抗體可直接阻斷精卵融合,從而發揮免疫避孕功能。

2.3 Izumo的親水性分析 按Kyte-Doolittle的氨基酸親水性標準分析Izumo的親水性,預測結果表明Izumo蛋白分子Izumo親水性區域的分布不均勻,主要密集在中部和C末端,尤其以中部親水性最高,親水性較高區域為第 36～77、82～108、116～124、128～ 139、149～176、184～220、223 ～239、257～ 270、272～276、278～290、313～320和334～350區段（圖5）。這些親水性區域暴露于蛋白表面的幾率較大,成為抗原表位的幾率也較大。

2.4 Izumo蛋白的表面可能性分析 采用Emini方法對Izumo蛋白的表面可能性進行了分析。結果顯示Izumo蛋白的氨基酸表面可能性較大的區域主要是第36～40、48～ 52、93～ 99、117～ 124、129～ 133、204～ 208、212～ 219、227 ～ 231、257～ 264、271 ～ 276、283～289、313～318和 335～350區段,其它區段展示的表面可能性較小或表現為負值（圖6）。表明表面可能性較高區域呈現在Izumo分子表面,而表面可能性較低區域,即埋藏于分子內部的區域。

2.5 Izumo抗原指數分析 采用Jameson-Wolf方法分析 Izumo蛋白潛在的抗原表位位點,結果顯示Izumo蛋白質分子第 35～42、45～67、69～75、79～89、92～108、117 ～ 123、129 ～ 141、149 ～ 182、189～198、203～209、210 ～ 220、223～ 244、256～280、283 ～292、313～322和 330～350區段抗原指數較高（圖7）,提示這些區段含有潛在優勢抗原表位。

圖4 Izumo的柔性區域Fig.4 Flexib le regions of Izumo protein

圖5 Izumo蛋白的親水性分析Fig.5 Hyd rophilicity analysis of Izumo protein

圖6 Izumo蛋白表面可能性區域Fig.6 Surface probability regions of Izumo protein

圖7 Izumo蛋白抗原指數分析Fig.7 Antigenic index of Izumo protein

3 討論

當前研發男性免疫避孕疫苗,進行抗生育研究的靶標分子主要有兩方面:①精子表面在受精過程中發揮作用的蛋白;②參與精子與卵細胞表面卵透明帶結合的蛋白。目前針對精子特異表達分子的研究主要有 LDH-C4 、FA-1、SP10、SP17、PH-20、PH-30、（SAMP）32、ADAM、CD9、YLP12等[4],但它們大部分抗生育效率不高。其中睪丸特異表達分子Eppin的研究成果向生育學家展示出誘人的魅力,重組Eppin免疫雄猴使78%的雄猴產生高滴度的特異抗體并出現不育癥,免疫停止后能恢復育性[5,6]。目前的研究都還僅僅只停留在動物模型研究上,尚沒有一種真正可用于臨床的安全、長效、可逆的男性避孕抗原問世。

Izumo是目前唯一報道的精子膜蛋白,為免疫球蛋白超家族Ⅰ型膜蛋白新成員,含一個糖基化位點的胞外免疫球蛋白域,在2005年由日本學者Inoue等命名并首次報道。研究表明Izumo蛋白的糖基化位點對于Izumo蛋白發揮功能不是必需的[7]。在動物受精過程中,精子與卵子相遇、識別對方,并融合形成一個新的生命體。Izumo蛋白在發生頂體反應后,精子和卵子融合過程中發揮重要作用[8],可見Izumo蛋白為控制生育提供了理想的靶標,成為人類避孕領域關注的新焦點。研究者預言,運用RNAi技術可以開發出Izumo長效避孕的方法,在睪丸中注射Izumo雙鏈RNA（從睪丸中分離獲得IzumomRNA而來）,抑制睪丸中Izumo蛋白的表達量從而可以達到男性長效避孕。此外,通過注射Izumo單抗,抗原與抗體結合抑制精卵結合從而達到短期避孕。體外研究的結果表明鼠Izumo抗體能阻止精卵融合,但體內研究顯示鼠Izumo抗體并不影響小鼠生育[9]。進一步的研究表明,Izumo抑制小鼠試管受精生育率及交配率是依賴于劑量效應[10]。Izumo蛋白真正成為高效的免疫避孕靶抗原尚需進一步研究。

抗原的特異性主要由其特定的表位來體現,抗原的研究也正在由天然大分子向亞單位、表位多肽過渡。一個理想的疫苗應該是屏蔽病理、劣勢、非中和的表位,多個優勢、中和性表位的組合。研究蛋白的二級結構并預測B細胞優勢抗原表位,對于進一步探索蛋白的活性功能具有重要作用。2008年本課題組預測出Eppin優勢中和性B細胞表位,體外動物實驗表明75%所預測的潛在表位位點能與抗血清結合[11]。進一步的研究表明,動物實驗篩選出優勢表位抗原肽均能使雄性小鼠體內產生高滴度抗體,但并非所有篩選出的優勢表位抗原肽均能產生較好的抗生育效能[12]。由此可見,蛋白二級結構及B細胞抗原表位預測的結果為蛋白活性部位發揮功能提供研究靶標位點,但是抗原發揮活性的表位尚需與深入的蛋白功能驗證相結合才能確定。目前全世界Izumo蛋白抗生育的研究正如火如荼地進行,但尚少見Izumo表位成功預測及鑒定的報道。

本研究運用目前發展成熟的分子生物學軟件對Izumo的二級結構和表位特性,如親水性、柔韌性、表面可能性及抗原指數等方面進行分析,成功預測其B細胞抗原表位。結果表明Izumo存在多個潛在的抗原表位位點,蛋白第 36～42、62～66、94～99、118～ 122、129～132、151 ～154、161～ 164、173～ 177、205～ 208、212～216、256 ～265、271～ 276、283～ 288、314～318和336～350區段附近可能為B細胞表位優勢區域。其優勢表位的確證在進一步研究中。

1 Yamashita M,Yamagata K,Tsumura Ketal.Acrosome reaction ofmouse epididymal sperm on oocyte zona pellucida[J].JReprod Dev,2007;53:255-262.

2 Inoue N,Ikawa M,Isotani Aetal.The immunoglobulin superfam ily protein Izumo is required for sperm to fusewith eggs[J].Nature,2005;434:234-238

3 Sun X,Wang H,Okabe Metal.Genetic loss of faah comprom isesmale fertility inm ice[J].Biol Reprod,2008;5:1-21.

4 Naz RK.Antisperm immunity for contraception[J].Journal of Andrology,2006;27（2）:153-159.

5 Richardson R T,Sivashanmugam P,Hall Setal.Cloning and sequencing of human Eppin:a novel fam ilyofprotease inhibitorsexpressed in theepididym isand testis[J].Gene,2001;270:93-102.

6 O'Rand M G,Widgren E E,Sivashanmugam Petal.Reversible immunocontraception inmalemonkeys immunized with eppin[J].Science,2004;306（5699）:1189-1190.

7 Inoue N,Ikawa M,Okabe M.Putative sperm fusion protein IZUMO and the role of N-glycosylation[J].Biochem Biophys Res Commun,2008;377:910-914.

8 Yamashita M,Honda A,Ogura Aetal.Reduced fertility ofmouse epididymal sperm lacking Prss21/Tesp5 is rescued by sperm exposure to uterinem icroenvironment[J].Genes to Cells,2008;13:1001-1013.

9 Wang D,Huang T,Xie Qetal.Investigation of recombinantmouse sperm protein izumo as a potential immunocontraceptive antigen[J].Am J Reprod Immunol,2008;59:225-234.

10 Wang M,Lv Z,Shi Jetal.Immunocontraceptive potential of the Ig-like domain of Izumo[J].Mol Reprod Dev,2009;76（8）:794-801.

11 李晉濤,陳正瓊,梁志清etal.Eppin抗原的二級結構分析B細胞表位預測[J].第三軍醫大學學報,2008;30（24）:2254-2257.

12 Chen Z,HeW,Liang Zetal.Protein prime-peptideboostasanew strategy induced an Eppin dominant B-cell epitope specific immune response and suppressed fertility[J].Vaccine,2009;27（5）:733-740.

[收稿2009-05-10 修回2009-07-16]

（編輯 倪 鵬）

Prediction of the secondary structure and B cell epitopes for the Izumo p rotein of Homo Sapiens

YANGXia,LIUKai-Jun,SHENZi-Gang,HEHai-Yang,ZHANGJi,ZHANGQiao-Yu,WUYu-Zhang,LIJin-Tao.InstituteofImmunology,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China

Objective:To predictand analyze the secondary structure and B cell epitopes of Izumo protein.Methods:The secondary structure and flexible regions of Izumo protein were predicted by themethods of Chou-Fasman,Gam ier-Robson and Karplus-Schulz.Moreover,hydrophilicity plot,surface probability plot and antigenic index of Izumo protein were predicted by themethods of Kyte-Doolittle,Emini and Jameson-Wolf,respectively.Results:Izumo protein containedmoreαhelix regions.Therewere several centersofαhelix in the regions of6-17,30-40,88-99,103-120,153-160,173-188,249-260,283-297,334-338 and 339-346 of Izumo p rotein,and several centers ofβsheet in the regions of21-25,198-200,245-248 and 320-323.Moreover,many distinct B cell epitopesin Izumo protein possibly localized in the regionsof 36-42,62-66,94-99,118-122,129-132,151-154,161-164,173-177,205-208,212-216,256-265,271-276,283-288,314-318 and 336-350.Conclusion:These results are helpful for identification of the dominant B cellepitopes and the functional domains of Izumo protein.

Izumo protein;Secondary structure;B cell epitopes

R392.11

A

1000-484X（2010）01-0037-04

①本文受國家自然科學基金（30571708）、“十一五”國家科技支撐計劃（2006BAI03B12）資助

②為共同第一作者

③解放軍總醫院第二附屬醫院婦產科,北京100091

楊 霞（1979年-）,女,博士,講師,E-mail:oceanyx@126.com;

及指導教師:李晉濤（1970年-）,女,博士,副教授,主要從事病毒免疫學研究,E-mail:ljtqms@yahoo.com.cn。