CpG ODN對ZP121-140表位合成肽誘導的免疫應答和免疫避孕效應影響①

秦衛兵 王一峰 蔣 敏 蔣建偉 苗竹林 歐汝強 （廣東省計劃生育科學技術研究所,廣州 510600）

CpG ODN對ZP121-140表位合成肽誘導的免疫應答和免疫避孕效應影響①

秦衛兵 王一峰 蔣 敏 蔣建偉②苗竹林 歐汝強 （廣東省計劃生育科學技術研究所,廣州 510600）

目的:探討CpGODN對透明帶（ZP）抗原表位ZP121-140合成肽誘導的免疫應答和免疫避孕效應影響。方法:應用人工合成ZP2121-140表位肽,與20μg CpG ODN或等量完全弗氏佐劑（CFA）混懸后左脛前肌免疫雌性BALB/c小鼠,初次免疫后2、4、6周各加強免疫一次,共免疫四次。在每次加強免疫前和末次免疫后兩周斷尾取血,分離血清,分析特異性IgG抗體及非特異性細胞因子IFN-γ、TNF-α及IL-10水平;收集小鼠陰道沖洗液,離心取上清,分析特異性IgA抗體水平。免疫小鼠生育實驗結束后,取卵巢組織行病理學分析。結果:CpG ODN組誘導的特異性IgG和IgA水平較CFA組有增高趨勢,但無顯著性差異（P＞0.05）。CpG ODN組誘導的非特異性IFN-γ和TNF-α水平明顯高于CFA組（P＜0.05）;而CpG ODN組誘導的IL-10水平顯著低于CFA組（P＜0.05）。兩種佐劑對小鼠的受孕率影響沒有顯著性差異,但CpG ODN組孕鼠每胎產仔數明顯低于CFA組（P＜0.05）。病理學分析顯示實驗小鼠卵巢組織無病理性變化。結論:CpGODN對ZP121-140合成肽誘導的免疫應答和免疫避孕效應略優于CFA,更適合用于避孕疫苗佐劑研究。

CpG ODN;透明帶;合成肽;免疫避孕

透明帶（Zona pellucida,ZP）是包被在哺乳動物卵母細胞外的糖蛋白結構,具有種屬特異性的精子受體,是開發免疫避孕疫苗理想的靶標。Sun等從ZP2103-134中篩選有效的抗原表位,發現ZP2121-140能明顯降低小鼠的受孕率和每胎產仔數,是一個理想的免疫避孕靶標[1]。但由于多肽疫苗的免疫原性較弱,因此,要使疫苗達到完全避孕效果仍需尋找合適的佐劑來增強疫苗的免疫效果。細菌DNA中存在非甲基化的CpG二核苷酸序列（即CpG基序）能激活免疫系統,誘導天然免疫應答分泌免疫球蛋白和各種細胞因子[2]。人工合成的含有CpG基序的寡聚脫氧核苷酸（CpG oligodeoxynucleotide,CpGODN）同樣具有細菌CpG DNA的免疫刺激作用,是一種新型疫苗佐劑[3]。CpG ODN已被廣泛應用于預防感染性疾病和腫瘤等多種疾病疫苗研究中,但目前較少見CpG ODN應用于避孕疫苗研究。本文應用化學合成肽技術合成ZP121-140表位肽,分別以CpG ODN和CFA為佐劑免疫雌性BALB/c小鼠,探討其誘導的特異性IgG和IgA抗體水平、非特異性細胞因子水平及免疫避孕效應,為研制ZP避孕疫苗提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 化學合成ZP2121-140表位肽 選擇小鼠透明帶ZP2121-140表位肽:TDVRYKDDMYHFFCPAIQAQ,化學合成方法見文獻[4]。

1.1.2 CpGODN 全鏈硫代修飾,PAGE純化,由上海生工生物工程公司合成,序列:5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′。

1.1.3 實驗動物 BALB/c雌、雄性小鼠（6～8周齡,體重18～24克）,其中雌性小鼠 30只,雄性小鼠15只,購自中山大學醫學院動物中心。小鼠飼養及實驗均在中山大學醫學院動物中心進行。

1.2 方法

1.2.1 免疫雌性小鼠 實驗分3組,每組10只。ZP+NS組:每只小鼠左脛前肌注射100μl含100μg合成肽的NS;ZP+CFA組:每只小鼠左脛前肌注射100μl含100μg合成肽的CFA懸液;ZP+CpG 組:每只小鼠左脛前肌注射100μl含100μg合成肽和20 μg CpG混合液。初次免疫后2、4、6周各加強免疫一次,共免疫四次。

1.2.2 收集血清和陰道沖洗液 在每次加強免疫前和末次免疫后兩周斷尾取血,離心后取上清,-20℃保存;在每次加強免疫前和末次免疫后兩周取陰道沖洗液,方法為用平頭微量注射器取50μl NS陰道沖洗 3次,收集沖洗液后,離心取上清,-20℃保存。

1.2.3 檢測抗體和細胞因子 用0.1%PBS（pH7.2）稀釋合成肽后包被于96孔酶標板（美國Sigma公司產品）,以1∶100稀釋的小鼠待測血清或陰道沖洗液為一抗,再分別加入HRP-山羊抗小鼠IgG（武漢博士德公司產品）或HRP-山羊抗小鼠IgA（武漢博士德公司產品）為二抗,OPD為底物,在酶標儀（美國Bio-Rad公司產品）上讀取A450值。

采用ELISA試劑盒定量檢測細胞因子IFN-γ、TNF-α及IL-10,嚴格按試劑盒說明書操作。

1.2.4 免疫小鼠的生育實驗 在末次免疫結束后2周,將實驗雌鼠與有生育能力的正常雄鼠按2∶1合籠,次日檢查陰道栓,將受孕雌鼠單獨飼養。觀察受孕小鼠的妊娠和每胎產仔情況。

1.2.5 卵巢病理切片觀察 全程實驗結束后,處死雌性實驗小鼠,取卵巢組織,予以丙酮固定10分鐘,常規脫水,浸蠟包埋。用APES對載玻片進行防脫片處理;石蠟切片機中將石蠟包埋的標本切成4μm厚的切片。將石蠟切片常規脫蠟至水,蘇木素-伊紅染色,脫水,封片,光學顯微鏡下觀察卵巢組織變化。

2 結果

2.1 CpG ODN對ZP2121-140合成肽誘導的血清中特異性IgG抗體應答影響 由圖1可知,在免疫后的不同時間點,ZP+CFA組誘導的血清中特異性IgG抗體均明顯高于ZP+NS組（P＜0.05）;ZP+CpG組誘導的血清中特異性IgG抗體也均明顯高于ZP+NS組（P＜0.05）;而ZP+CpG組誘導的特異性IgG抗體與ZP+CFA組誘導的特異性IgG抗體在不同時間點均無顯著性差異（P＞0.05）。ZP+CpG組血清中特異性IgG抗體在免疫后6周左右達到高峰,維持2周左右開始下降。

2.2 CpG ODN對ZP2121-140合成肽誘導的陰道粘膜特異性IgA抗體應答影響 由圖2可知,在免疫后的不同時間點,ZP+CFA組誘導的陰道粘膜特異性IgA抗體均明顯高于ZP+NS組（P＜0.05）;ZP+CpG組誘導的特異性IgA抗體也均明顯高于ZP+NS組（P＜0.05）;而ZP+CpG組誘導的特異性IgA抗體與ZP+CFA組誘導的特異性IgA抗體在不同時間點均無顯著性差異（P＞0.05）。ZP+CpG組陰道粘膜中特異性IgA抗體在免疫后8周左右達到高峰,維持2周左右開始下降。

圖1 CpG ODN對ZP2121-140合成肽誘導的血清中特異性IgG抗體應答影響Fig.1 Effect of CpG ODN on the specific IgG response induced by ZP2121-140 synthetic peptide in sera

2.3 CpG ODN對ZP2121-140合成肽誘導的血清中非特異性細胞因子水平影響 由圖3～5可知,在免疫后的不同時間點,ZP+CFA組和ZP+CpG組誘導的血清中非特異性細胞因子IFN-γ和TNF-α水平均明顯高于ZP+NS組（P＜0.05）;ZP+CpG組誘導的血清中非特異性細胞因子IFN-γ和TNF-α水平又顯著高于ZP+CFA組（P＜0.05）;但ZP+CpG組誘導的血清中非特異性細胞因子IL-10水平顯著低于ZP+NS組和ZP+CFA組（P＜0.05）。

2.4 CpG ODN對ZP2121-140合成肽的免疫避孕效應影響 由表 1可知,單純ZP2121-140合成肽只能使10%的實驗小鼠完全不孕;而CpG ODN或CFA聯合ZP2121-140合成肽均能使30%實驗小鼠完全不孕;且CpGODN聯合ZP2121-140合成肽能使孕鼠的每胎產仔數明顯低于CFA聯合ZP2121-140合成肽組（P＜0.05）。

圖2 CpG ODN對ZP2121-140合成肽誘導的陰道粘膜特異性IgA抗體應答影響Fig.2 Effect of CpG ODN on the specific IgA response induced by ZP2121-140 synthetic pep tide in vaginalmucosa

圖3 CpG ODN對ZP2121-140合成肽誘導的血清中IFN-γ水平影響Fig.3 Effect of CpG ODN on the IFN-γlevel induced by ZP2121-140 synthetic peptide in sera

圖4 CpG ODN對ZP2121-140合成肽誘導的血清中 TNF-α水平影響Fig.4 Effect of CpG ODN on the TNF-αlevel induced by ZP2121-140 synthetic pep tide in sera

圖5 CpG ODN對ZP2121-140合成肽誘導的血清中IL-10水平影響Fig.5 Effect of CpG ODN on the IL-10 level induced by ZP2121-140 synthetic peptide in sera

表1 CpG ODN對ZP2121-140合成肽的免疫避孕效應影響Tab.1 Effect of CpG ODN on the immune-contraception caused by ZP2121-140 synthetic peptide

圖6 ZP2121-140合成肽聯合CpG ODN對實驗小鼠卵巢組織的影響（H-E染色,×20）Fig.6 Effect of CpG ODN and ZP2121-140 synthetic peptide on the ovarial pathology of experimentedm ice（H-E,×20）

2.5 ZP2121-140合成肽聯合CpG ODN對實驗小鼠卵巢組織的影響 對實驗小鼠的卵巢組織進行病理學分析,結果發現實驗小鼠的卵巢組織無明顯炎癥細胞浸潤現象,卵泡的細胞形態、數目均未見明顯異常（如圖6所示）。

3 討論

當今人口問題是一個世界性的問題,控制人口是全球面臨的問題。據預測,到2020年全球育齡人口將超過10億,2050年全球人口總數將突破100億。而我國是世界第一人口大國,控制人口增長對我國經濟社會發展尤為重要。開發免疫避孕疫苗是控制人口增長的有效措施,符合我國基本國策。ZP是包被在哺乳動物卵母細胞外的糖蛋白結構,具有種屬特異的精子受體。ZP的生物學功能涉及受精過程的精卵相互作用、阻止多精子受精和保護著床前胚胎。用天然和重組的ZP抗原在包括非人靈長類動物的異種免疫可抑制被免疫動物的生育力,導致不育。一些研究表明ZP抗原免疫在獲得抗生育作用結果的同時觀察到對卵巢的結構與功能存在不同程度的影響。用ZP抗原免疫引起的卵巢功能紊亂是發展人用ZP避孕疫苗要克服的關鍵問題。ZP抗原免疫引起卵巢功能紊亂嚴重的可出現原始卵泡丟失、卵巢功能衰竭。為避免自身免疫對卵巢的干擾,一些研究者用合成肽免疫篩選ZP抗原的B細胞決定簇,發展避孕疫苗。但開發ZP避孕疫苗就必須克服免疫原性弱和引起自身免疫性卵巢炎,針對上述問題,我們分別采用新型高效疫苗佐劑和表位合成肽策略,以期開發出理想的ZP避孕疫苗。

弗氏佐劑是動物實驗中最常使用的佐劑,可分為弗氏完全佐劑（CFA）和弗氏不完全佐劑（IFA）,CFA作用較強,但易在注射局部形成肉芽腫和持久性潰瘍,甚至關節炎,故不適合人體使用。近年來,人們發現人工合成的CpG ODN在一些研究中被證明具有很好的佐劑作用[5,6]。CpGODN是模擬細菌DNA的短片狀核酸序列,含有高頻率的非甲基化CG,這一特性使它被哺乳動物免疫系統識別為異己成分,激起免疫應答。根據CpGODN的結構及其對不同免疫細胞的激活作用,將CpG ODN分為3類[7-9]:A型CpG ODN可以刺激漿細胞樣樹突狀細胞產生大量α干擾素進而激活NK細胞并引起γ干擾素的分泌,但對刺激B細胞活化的作用較弱;B型CpGODN有很強的刺激B細胞活化的作用,但刺激漿細胞樣樹突狀細胞產生α干擾素的作用較弱;C型CpGODN兼具A型和B型CpGODN的作用。與傳統的油劑免疫佐劑不同,CpG ODN在誘導高水平抗體應答同時能誘導出強烈的Th1型免疫應答[10]。眾所周知,正常妊娠的維持有賴于體內Th2型免疫應答,而強烈的Th1型免疫應答不利于受精卵著床,如果一種避孕疫苗能在誘導高水平抗體同時又能誘導出強烈的Th1型免疫應答,則即便精子與卵子能夠結合成受精卵也不易著床。因此,將CpGODN用于避孕疫苗研究可能具有增強疫苗的避孕效應。最近,Conforti等將CpG ODN 2006應用于避孕疫苗研究,應用重組LHRH疫苗聯合不同佐劑免疫小母牛,發現CpG ODN 2006的佐劑作用較布氏分枝桿菌作用強,與CFA的作用相當[5,11]。

由于ZP2是小鼠精子的次級受體,利用其受體相關的B細胞表位肽段作抗原是發展多表位抗原避孕疫苗的一種策略。Sun等從ZP2103-134中篩選有效的抗原表位,發現ZP2121-140能誘導出高水平IgG抗體,該抗體能與小鼠的ZP結合,提示ZP2121-140可能同時含有B細胞表位和Th細胞表位,免疫B6AF1小鼠后,能明顯降低小鼠的受孕率和每胎產仔數,是一個理想的免疫避孕靶標[1]。本研究應用人工合成ZP2121-140表位肽,與CpG ODN或CFA聯合免疫雌性BALB/c小鼠,結果發現CpG ODN能明顯提高小鼠血清中特異性IgG和陰道沖洗液中IgA水平,其增強抗體應答效應與CFA相當;但CpGODN誘導的非特異性Th1型應答優于CFA;兩種佐劑對小鼠的受孕率影響沒有顯著性差異,但CpGODN降低孕鼠每胎產仔數明顯優于CFA。CpG ODN能使ZP2121-140表位肽誘導的特異性抗體應答維持2周左右的高水平,之后有下降趨勢,表明ZP2121-140表位肽疫苗的避孕效應可能具有可逆性。病理學分析發現ZP2121-140合成肽對實驗小鼠卵巢中的卵泡形態無明顯影響,可能是由于ZP2121-140中T細胞表位在體內被加工處理后,提呈到卵巢抗原提呈細胞上的T細胞表位并非是引起卵巢炎癥反應的T細胞表位,ZP2121-140中T細胞表位的隱匿性使得ZP2121-140合成肽不會引起自身免疫性卵巢炎。應用CpGODN佐劑對實驗小鼠卵巢中的卵泡形態也無明顯影響,表明CpGODN作為避孕疫苗佐劑是安全的。本研究表明CpG ODN對ZP2121-140合成肽誘導的免疫應答和免疫避孕效應略優于CFA,更適合用于避孕疫苗佐劑研究。

1 SunW,Lou YH,Dean Jetal.A contraceptive peptide vaccine targeting sulfated glycoprotein ZP2 of themouse zona pellucida[J].Biol Reprod,1999;60（4）:900-907.

2 Krieg AM.CpGmotifs in bacterial DNA and their immune effects[J].Annu Rev Immunol,2002;20（10）:709-760.

3 DavisH L,Weeranta R,Waldschmidt TJetal.CpG DNA isa potent enhancer of specific immunity inm ice immunizedwith recombinanthepatitis B surface antigen[J].JImmunol,1998;160（2）:870-876.

4 蔣 敏,秦衛兵,王一峰etal.透明帶抗原表位肽的合成及其誘導的特異性抗體水平[J].實驗與檢驗醫學,2008;26（3）:257-258.

5 ConfortiV A,de Avila DM,CummingsN Setal.The effectivenessof a CpGmotif-based adjuvant（CpG ODN 2006）for LHRH immunization[J].Vaccine,2007;25（35）:6537-6543.

6 Zhang Y,Palmer G H,Abbott JRetal.CpG ODN 2006 and IL-12 are comparable forpriming Th1 lymphocyteand IgG responses in cattle immunizedwith a rickettsial outer membrane protein in alum[J].Vaccine,2003;21（23）:3307-3318.

7 Wilson H L,DarA,Napper SKetal.Immunemechanismsand therapeutic potential of CpG oligodeoxynucleotides[J].Int Rev Immunol,2006;25（324）:183-213.

8 Krieg AM.Therapeutic potential of Toll-like receptor activation[J].Nat Rev Drug Discov,2006;5（6）:471-484.

9 K linman D M.Adjuvant activity of CpG oligodeoxynucleotides[J].Int Rev Immunol,2006;25（324）:135-154.

10 Vollmer J,Weeratna R D,Jurk Metal.Oligodeoxynucleotides lacking CpG dinucleotidesmediateToll-like receptor9 dependent Thelper type 2 biased immune stimulation[J].Immunology,2004;113（2）:212-223.

11 ConfortiV A,de Avila DM,Cumm ings N Setal.CpGmotif-based adjuvant asa replacement for Freund's completeadjuvant in a recombinant LHRH vaccine[J].Vaccine,2008;26（7）:907-913.

[收稿2009-06-04 修回2009-08-12]

（編輯 張曉舟）

The effect of CpG ODN on the immune responses and immune-contracep tion induced by ZP121-140synthetic peptide

QINWei-Bing,WANGYi-Feng,JIANGMin,JIANGJian-Wei,MIAOZhu-Lin,OURu-Qiang.FamilyPlanningResearch InstituteofGuangdong,Guangzhou510600,China

Objective:To investigate the effectof CpG ODN on the immune responses and immune-contraception induced by ZP121-140synthetic pep tide.Methods:BALB/cmicewere given an injection into the left tibialis anteriormuscle of ZP121-140synthetic peptidewith 20μg CpG ODN orCFA,then them iceweregiven other injections at2,4,6weeksusing the same formulation.Themice's bloodwas collected before each vaccination and after the last vaccination every 2weeks.The specific IgG and IgA in seraand non-specific cytokines IFN-γ,TNF-α,IL-10 in vaginalmucosaweremeasured by ELISA.Theovarial pathological changeswereundertakenusinghematoxylinand eosin-stained paraffin sections.Results:The specific IgG in sera and IgA in vaginalmucosa induced by ZP121-140synthetic peptide combinedwith CpG ODNwere nomore than those of ZP121-140synthetic peptide combined with CFA.Therewere significant increases in IFN-γand TNF-αwhen CpGODN wasm ixed with ZP121-140synthetic peptide and the increaseofCpGODN wasmore significant than thatof CFA.Otherwise therewas a significantdecrease in IL-10 when CpG ODNwasmixedwith ZP121-140synthetic peptide and the decreaseof CpGODNwasmore significant than thatof CFA.There was no significant difference in the rate of pregnancy between CpG ODN group and CFA group,but the average number ofbirthmice in CpG ODN group was less than thatin CFA group.No pathological changeswere found in the ovariesof experimentalmice.Conclusion:The adjuvant effectof CpG ODN ismore advantageous than that of CFA in contraception vaccine research.

CpG ODN;Zona pellucida;Synthetic peptide;Immune-contraception

R392.12

A

1000-484X（2010）01-0046-05

①本文為廣東省計劃生育委員會科研基金資助項目（No.2004003）

②暨南大學醫學院生化教研室,廣州510632

秦衛兵（1975年-）,男,在讀博士,助理研究員,主要從事生殖免疫研究。

·中醫中藥與免疫·