兩株鼠抗人VSIG4單克隆抗體的研制及其生物學特性的研究

張世杰 王 蕾 汪家敏 陳 曦 蔣 靚 王月穎 胡玉敏 張學光 顧宗江

（蘇州大學醫學生物技術研究所,蘇州 215007）

兩株鼠抗人VSIG4單克隆抗體的研制及其生物學特性的研究

張世杰 王 蕾①汪家敏 陳 曦 蔣 靚 王月穎 胡玉敏 張學光 顧宗江

（蘇州大學醫學生物技術研究所,蘇州 215007）

目的:制備鼠抗人VSIG4分子單克隆抗體（mAb）及對其生物學特性進行鑒定。方法:以高表達膜型VSIG4分子的基因轉染細胞L929/VSIG4L為免疫原,常規免疫BALB/c小鼠,采用雜交瘤技術,經流式細胞術檢測和多次克隆化培養,篩選出特異分泌鼠抗人VSIG4分子的雜交瘤細胞株;采用間接免疫熒光法、Western b lot、競爭抑制試驗及MTT增殖試驗等對單抗的生物學特性進行鑒定。結果:獲得2株持續、穩定分泌鼠抗人VSIG4mAb的雜交瘤細胞株,分別命名為9A7和9D5。對mAb生物學特性的研究結果表明,2株mAb均能識別巨噬細胞以及Jurkat、THP-1、H 446等腫瘤細胞株表面的VSIG4分子。對T細胞增殖抑制的阻斷實驗顯示,這2株抗體對VSIG4分子抑制T細胞增殖均有阻斷作用。結論:成功地獲得了2株鼠抗人VSIG4功能性mAb,為進一步研究VSIG4及其未知受體的生物學功能奠定了基礎。

VSIG4;雜交瘤;單克隆抗體;巨噬細胞

VSIG4（V-setand Ig domain containing 4）是一種新的B7家族相關蛋白,又稱為CRIg,其最先作為免疫球蛋白超家族的Z39Ig基因被克隆出來,定位于人X染色體的Xq12[1-3]。VSIG4是一種Ⅰ型跨膜分子,屬于免疫球蛋白超家族成員。人的VSIG4有兩種交替剪接形式:VSIG4L（the longer form of human VSIG4）,胞外區編碼IgV和IgC兩個結構域,VSIG4S（the short form of human VSIG4）胞外只編碼IgV結構域,其胞內區二者完全相同[2-4]。人VSIG4的mRNA高表達于成人肺、胎盤、肝和心臟等組織,并且發現VSIG4主要表達于單核細胞來源的巨噬細胞[2-7],即VSIG4主要表達于定居于肝臟、心、腎上腺、肺和腹腔等中的巨噬細胞,而在外周血單核細胞中幾乎沒有表達。先前的研究已經發現VSIG4是巨噬細胞上的補體受體,可結合補體C3的降解片段C3b和iC3b,對于病原體的吞噬起重要作用[8-10]。近來Vogt等[3]發現VSIG4還是一種新的B7家族相關分子,并且證實了VSIG4有抑制T細胞活化的作用。

由于對VSIG4分子的研究尚處于初始階段,國內尚未見有VSIG4單克隆抗體的報道。因此,研制抗人VSIG4單克隆抗體,有利于檢測組織細胞上VSIG4分子的表達并研究其臨床意義,同時也為探討單抗對VSIG4分子的信號阻斷作用提供了有用的工具。

1 材料與方法

1.1 材料 RPM I1640、DMEM（Gibco）,小牛血清（Hyclone）,HAT、HT選擇培養基（Sigma）,PEG1500（Roche）,Protein G親和層吸柱（Pharmacia）,IgG亞類快速定性試紙（Argen）;兔抗人VSIG4多克隆抗體購自奧維亞公司;細胞株:Jurkat、THP-1、H446、H460、SPCA-1均購自ATCC,并由本實驗室保種。轉人VSIG4基因細胞株 L929/VSIG4L、L929/VSIG4S、L929/mock 及 293T/VSIG4L、293T/VSIG4、293T/mock由本所構建并保種,所有細胞株經檢測,均無支原體污染,實驗動物:6～8周齡的雌性BALB/c小鼠（上海實驗動物中心）,本校實驗動物中心協助飼養。

1.2 方法

1.2.1 雜交瘤細胞株的建立 以高表達人VSIG4分子的L929/VSIG4L基因轉染細胞為免疫原免疫BALB/c小鼠,腹腔注射1×107/只,第3周和第5周再次免疫。融合前3～4天加強免疫后,取小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0（5∶1）按常規方法進行細胞融合,用含HAT的DMEM培養,10天后改用含HT的DMEM培養,2周后不再向培養基中添加HT。融合約10天后,以293T/VSIG4L基因轉染細胞及293T/VSIG4S基因轉染細胞為陽性抗體篩選細胞,293 T/mock為陰性抗體篩選細胞。通過間接免疫熒光標記和流式細胞術檢測雜交瘤培養上清進行篩選,所獲得的陽性克隆經有限稀釋法亞克隆,直至抗體穩定分泌后擴大培養并及時液氮凍存。

1.2.2 mAb的Ig亞類及特異性鑒定 采用快速定性試紙法（參照說明書）對所獲得的mAb進行小鼠Ig亞類的鑒定。Western blot鑒定抗體的特異性,抗原標本使用預冷的RIPA抽提293T/VSIG4L、293T/VSIG4S和293T/mock后所獲得的細胞膜蛋白,一抗使用雜交瘤培養上清（1∶50稀釋）,二抗為羊抗鼠Ig（1∶1 000）,通過ECL化學發光成像。

1.2.3 腹水型mAb的制備及純化 采用誘生腹水法制備抗體。選擇6～8周齡雌性BALB/c小鼠,經腹腔注射降植烷先行致敏（0.5ml/只）,1周后注射生長良好的雜交瘤細胞5×106/只,5～10天后收集腹水。采用Protein G親和層析法純化mAb。

1.2.4 免疫熒光標記的競爭抑制分析 將抗人VSIG4mAb（9A7和9D5）分別以生物素（biotin）標記。PBS洗滌293T/VSIG4L細胞（5×105/test）后,分別加入mAb,4℃孵育30分鐘,洗滌后接著加入生物素標記的mAb（0.2μg/test）,4℃孵育30分鐘,洗滌后再加入avidin-PE,4℃孵育30分鐘后洗滌,進行流式細胞儀分析,同時設陽性和陰性對照。

1.2.5 mAb對不同細胞表面VSIG4分子的識別采用M-CSF刺激外周血單核細胞獲取的巨噬細胞和本科室的腫瘤細胞株（5×105/test）,用PBS洗滌后分別加入2株生物素標記的mAb 9A7和9D5,4℃孵育30分鐘,洗滌后加入avidin-PE,4℃孵育30分鐘,洗滌后上流式細胞儀分析表型。

1.2.6 單抗對VSIG4分子的信號阻斷作用 分別用絲裂霉素MMC（20 mg/L）處理基因轉染細胞293T/VSIG4L及293T/VSIG4S 2小時,洗滌后分別將它們與9A7和9D5單抗共育40分鐘后作為效應細胞。從PBMC中經磁珠純化的T細胞,將上述處理的效應細胞（1×104/孔）與T細胞（1×105/孔）混合,接種到預先用抗人CD3激發型mAb（0.5mg/L）包被的96孔板中。共培養3天后以MTT法測定T細胞增殖情況。每組均以相同條件下293T/mock基因轉染細胞及未加抗體的293T基因轉染細胞作為對照。

2 結果

2.1 特異分泌鼠抗人VSIG4 mAb雜交瘤的建株通過L929/VSIG4L轉基因細胞連續3次免疫小鼠,第4次加強免疫后的血清抗體效價可達1∶103以上。采用雜交瘤技術,對免疫小鼠脾細胞與SP2/0細胞進行融合。用293T/VSIG4L及293T/mock細胞分別作為抗體篩選的陽、陰性細胞株,多次間接免疫熒光法篩選及克隆化培養,最終獲取2株持續分泌特異性mAb的雜交瘤細胞株,命名為9A7和9D5。單抗 9A7能特異性識別結合L929/VSIG4L、L929/VSIG4S和293/VSIG4L、293/VSIG4S基因轉染細胞;單抗9D5識別L929/VSIG4L和293/VSIG4L,但不識別L929/VSIG4S和293/VSIG4S;且此兩株上清均不與對照細胞L929/mock和293/mock結合（圖1、2）。在體外連續傳代培養3個月以上或液氮凍存半年后復蘇,雜交瘤細胞生長良好,分泌抗體的性能穩定。

圖1 FCM分析單抗9A7與VSIG4基因轉染細胞的結合Fig.1 FCM analysis of 9A7 m Ab recognizing the VSIG4 on the transfected cells

2.2 mAb Ig亞類、效價及特異性的鑒定 經快速定性試紙法鑒定2株抗體的重鏈均為IgG1,兩者輕鏈均為κ。采用本室建立的腹水誘生方法生產的mAb效價,經間接免疫熒光及FCM分析,腹水型mAb及純化后抗體的效價均在1∶104以上,純化后抗體蛋白含量在2.0～2.5 g/L之間。Western blot分析結果顯示9A7能與VSIG4L和VSIG4S蛋白特異性結合,在43 kD上下有明顯陽性條帶,而9D5則只在VSIG4L泳道的47 kD左右有明顯特異性結合顯色條帶（圖3）。

2.3 單克隆抗體識別的抗原位點分析 以L929/VSIG4L為競爭靶細胞,經間接免疫熒光標記的競爭抑制試驗,結果顯示,單抗9A7和9D5不能相互阻斷對方與L929/VSIG4L細胞上VSIG4L分子的結合（圖4）。

圖2 FCM分析單抗9D5與VSIG4基因轉染細胞的結合Fig.2 FCM analysis of 9D5 m Ab recognizing the VSIG4 on the transfected cells

圖3 2株m Ab特異性識別VSIG4分子不同剪接體的Western blot分析Fig.3 Western b lot analysis of twom Abs specifically recognizing the two sp liceosomes of VSIG 4

2.4 單克隆抗體對不同人腫瘤細胞株及巨噬細胞表面VSIG4分子的識別 流式細胞術分析細胞膜熒光標記百分率結果表明,mAb 9A7和9D5均能特異識別M-CSF激發形成的人巨噬細胞上表達的VSIG4分子（圖5）,但是在PBMC中貼壁單個核細胞上近乎沒有VSIG4分子表達。在檢測腫瘤細胞株時發現,它們均能識別白血病細胞株Jurkat、THP-1和肺癌細胞株H446、H460、SPCA-1（圖6）。

2.5 單抗阻斷VSIG4分子對T細胞增殖的抑制作用 體外以抗人 CD3單抗激發 T細胞增殖,以VSIG4基因轉染細胞抑制,并加入本研究中制備抗體觀察其阻斷此效應,MTT檢測結果顯示,采用10 mg/L抗人VSIG4單克隆抗體9A7和9D5均能一定程度地阻斷VSIG4L介導的對T細胞的抑制作用（P＜0.05）,但9D5的阻斷效應不及9A7。同時9A 7也能阻斷VSIG4S介導的對 T細胞的抑制作用（P＜0.05）,但是 9D5對 VSIG4S沒有阻斷作用（P＞0.05）,（圖 7）。

圖4 間接免疫熒光標記的競爭抑制結果Fig.4 The competitive inhibition results acquired by indirect immunofluorescence

圖5 FCM檢測2株m Ab與單核細胞M0和巨噬細胞Mφ的結合反應Fig.5 Detection of binding of the twom Abs tomonocyte（M 0）and macrophage（Mφ）by FCM

圖6 FCM檢測2株m Ab與人腫瘤細胞株結合反應Fig.6 Detection of binding of the twom Abs to human cancer cell lines by FCM

圖7 單抗阻斷VSIG4分子對T細胞增殖的抑制作用Fig.7 Blockingof the VSIG4 inhibitory effects on proliferation of T cells by m Ab

3 討論

本研究以鼠源性L929細胞株構建成的基因轉染細胞L929/VSIG4L免疫BALB/c小鼠制備單克隆抗體。經反復篩選及多次的克隆化培養,最終獲得2株持續分泌特異性單抗的雜交瘤細胞株9A7和9D5。間接免疫熒光分析表明,9A7均可特異性識別表面有VSIG4L或VSIG4S的293T和L929基因轉染細胞;9D5只能識別VSIG4L的293T和L929基因轉染細胞,而VSIG4S的則不能識別。由于VSIG4L和VSIG4S是VSIG4分子不同的兩種長短剪接體形式,即VSIG4L胞外區編碼IgV和IgC兩個結構域,而短剪接體形式的VSIG4S胞外只編碼IgV結構域,二者的胞內則完全一致。同時以Western blot檢測也發現9A7能與VSIG4L和VSIG4S結合,9D5僅能和VSIG4L結合,說明9A7和9D5可以用作Western blot檢測,并且9A7和9D5的結合特異性也與間接免疫熒光分析結果相同。這些結果可基本判定9A7是與VSIG4L的IgV結構域結合;而9D5是與IgC結構域結合。上述結果尚不能排除IgV結構域和IgC結構域存在相同或相近的抗原位點,但9A7和9D5與VSIG4L的競爭抑制實驗證實二者不存在競爭抑制,說明9A7和9D5結合于IgV和IgC不同的抗原表位上。對兩株單抗的生物學功能研究結果表明,單抗9A7在一定程度上能夠阻斷VSIG4分子對T細胞的負性作用,使T細胞增殖增加,9D5僅能較低程度的阻斷VSIG4L的抑制作用,且阻斷效應不及9A 7明顯,而對VSIG4S幾乎沒有作用。所以可以推測VSIG4分子與其T細胞上表達的未知的受體的結合區域可能主要位于VSIG4分子的IgV結構域內。同時結合文獻[3]、本文及我們以前的研究結果[11],可以確定VSIG4分子的未知受體是T細胞上一個新的負性共刺激分子。

腫瘤的微環境是腫瘤細胞逃避機體免疫監視和攻擊的重要因素,腫瘤微環境中存在著高水平的抑制性B7分子。利用9A7和9D5,我們檢測了B7家族中新的抑制性分子VSIG4在腫瘤細胞株Jurkat、THP-1上的表達,其結果為陽性,這與文獻報道一致[5-7]。同時也檢測了部分肺癌細胞株,也發現它們的表面有不同程度的VSIG4分子的表達,且9A7和9D5間沒有明顯差別。是否VSIG4和它的未知受體是腫瘤微環境中起重要作用的一對新分子,有待進一步研究。

總之,對于VSIG4分子的研究尚處于初始階段,鼠抗人VSIG4單克隆抗體9A7和9D5研制成功為深入探討VSIG4分子的功能、表達定位以及共抑制分子對T細胞負性調節作用提供了良好的物質基礎,也對于進一步認識負性共信號分子在介導免疫應答平衡、腫瘤的免疫逃逸和維持外周耐受等的生物學機理方面具有重要意義。

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[收稿2009-02-10 修回2009-06-29]

（編輯 倪 鵬）

Preparation and characterization of two monoclonal antibodies against human VSIG4

ZHANGShi-Jie,WANGLei,WANGJia-Min,CHENXi,JIANGJing,WANGYue-Ying,HUYu-Min,ZHANGXue-Guang,GUZong-Jiang.BiotechnologyInstituteofSoochowUniversity,Suzhou215007,China

Objective:To prepare anti-VSIG4 monoclonal antibodies and characterize their biological functions.Methods:BALB/c mice were immunized with transfected cell line（L929/VSIG4L）as immunogen.The spleen B cellsof themicewere fusedwith SP2/0 and hybridoma cellswere screened with transfected cell line（L929/VSIG4）by FCM.After acquisition of the hybridomas secreting anti-VSIG4mAb,theirbiologicalactivitieswere investigated by indirect immunofluorescence,Western blot,competitive inhibition test,and MTT assay.Results:Two stable hybridomas,9A7 and 9D5wereobtained,which could continuously secrete specific anti-VSIG4monoclonal antibodies.The following biologicalactivity studies showed that thesemonoclonal antibodies could recognize thenatural VSIG4 expressed on themacrophages and several cancer cell lines,such as Jurkat,THP-1 and H446.Furthermore,they could block the inhibitory effects of VSIG4 on proliferation of T cells in vitro.Conclusion:Two hybridomas secreting anti-VSIG4monoclonal antibodies have been established.Thesemonoclonal antibodies provideuseful tools for further studying VSIG4′s biological function and its unknown receptor.

VSIG4;Hybridoma;Monoclonal antibody;Macrophage

R392.12

A

1000-484X（2010）01-0066-05

①蘇州大學附屬第一醫院心內科,蘇州215006

張世杰（1979年-）,男,博士,主要從事腫瘤免疫研究;通訊作者及指導教師:顧宗江（1956年-）,男,教授,主要從事腫瘤免疫和免疫調節研究,E-mail:szguzj@pub.sz.jsinfo.net。

·臨床免疫學·