醋柳黃酮在Krebs-Ringer試液中的穩(wěn)定性研究

謝 燕， 周麗峰， 曾曉麗， 李國(guó)文*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)源創(chuàng)科技有限公司，上海201203)

醋柳黃酮(flavonippophae)是從胡頹子科酸刺屬植物沙棘(醋柳，Hippophae Rhamnoides L.)中提取獲得的黃色或棕黃色粉末。其主要有效成分為黃酮類化合物，主要含槲皮素和異鼠李素及其苷［1］，系難溶性物質(zhì)，在甲醇、乙醇、乙酸乙酯及堿性水溶液中微溶，在水中極微溶解，這嚴(yán)重影響醋柳黃酮制劑的生物利用度，從而不能充分發(fā)揮療效。本實(shí)驗(yàn)在解決醋柳黃酮在腸營(yíng)養(yǎng)液中溶解性問(wèn)題的基礎(chǔ)上，對(duì)醋柳黃酮在Krebs-Ringer試液中的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，以期為醋柳黃酮腸吸收機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Sartorius CP225D型電子天平(Made by Sartorius);FA2004N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);PHS-3B微機(jī)型酸度計(jì)(上海理達(dá)儀器廠);SK7200LH型超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);RH-KT/C型加熱磁力攪拌器(IKA公司);Agilent Technologies 1200 Series HPLC(美國(guó)Agilent公司)。

醋柳黃酮(四川川大華西藥業(yè)股份有限公司，含量:13.69%，批號(hào):070301);槲皮素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100081-200406);異鼠李素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110860-200407);無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司批號(hào):20080114);Cremophor ELP(巴斯夫公司贈(zèng)送);磷酸 AR(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 批號(hào):T20061204);無(wú)水氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、六水合氯化鎂、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、葡萄糖、鹽酸及氫氧化鈉均為AR(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);甲醇為色譜純;水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 醋柳黃酮含量測(cè)定方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

取槲皮素對(duì)照品2 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，得槲皮素貯備液;取異鼠李素對(duì)照品2.5 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，得異鼠李素貯備液。分別精密移取槲皮素貯備液、異鼠李素貯備液1.5 mL至10 mL量瓶用流動(dòng)相定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液。每1 mL 中含槲皮素 3 μg、異鼠李素 7.5 μg。見(jiàn)圖 1。

圖1 醋柳黃酮的HPLC圖

2.1.2 色譜條件

Agilent 1200高效液相色譜儀;Kromasil 100-5C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸溶液(50∶50);檢測(cè)波長(zhǎng):371 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

2.1.3 Krebs-Ringer試液的配制［2］

分別稱取無(wú)水氯化鈣(CaCl2)0.37 g;氯化鈉(NaCl)7.8 g;氯化鉀(KCl)0.35 g;六水合氯化鎂(MgCl2·6H2O)0.47 g;磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)0.256 g;碳酸氫鈉(NaHCO3)1.37 g;葡萄糖(D-glc·H2O)1.54 g;依次加入至1 000 mL蒸餾水中，攪勻即得。

2.1.4 表面活性劑與乙醇含量對(duì)醋柳黃酮溶解度的影響

取適量空白K-R試液，以不同含量的無(wú)水乙醇(1%、2%、3%)及表面活性劑 Cremophor ELP(0.5%、1%、2%)組合，配制醋柳黃酮K-R試液，使其中醋柳黃酮原料的含量為100 μg/mL，按前述方法測(cè)定醋柳黃酮(以槲皮素和異鼠李素的總和計(jì))的含量。結(jié)果如表1。

表1 乙醇含量及表面活性劑含量對(duì)醋柳黃酮含量影響的考察/%

由表1的結(jié)果可知，在Krebs-Ringer試液中含乙醇量為2%，Cremophor ELP 0.5%時(shí)醋柳黃酮溶解度最大，因此，在該基礎(chǔ)上進(jìn)行穩(wěn)定性考察。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取適量空白K-R試液，其中含乙醇2%、Cremophor ELP 0.5%，調(diào)節(jié)pH值至6.8。分別取槲皮素、異鼠李素貯備液 0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 于10 mL量瓶中，以K-R試液(含2%無(wú)水乙醇、0.5%Cremophor ELP，pH6.8)定容至刻度。分別進(jìn)樣，以峰面積對(duì)槲皮素和異鼠李素的濃度分別進(jìn)行線性回歸，得槲皮素:C=0.011 6A+0.448 5(r=0.999 0)，異鼠李素:C=0.010 7A+0.122 7(r=0.999 5)，表明槲皮素和異鼠李素分別在0.512 5～8.2 μg/mL和1.225～19.6 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 醋柳黃酮在K-R試液中的穩(wěn)定性

2.2.1 醋柳黃酮乙醇濃配液的配制

取醋柳黃酮粉末0.5 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加少量無(wú)水乙醇超聲20 min使醋柳黃酮溶解，放冷后加無(wú)水乙醇定容。每1 mL含醋柳黃酮5 000 μg。

2.2.2 空白K-R試液pH對(duì)醋柳黃酮穩(wěn)定性的影響

分別取適量空白K-R試液，用1 mol/L NaOH及1 mol/L HCl調(diào)節(jié) pH 值至 5.4、6.8、7.4、7.8、7.9，加入醋柳黃酮乙醇濃配液以及Cremophor ELP，配制醋柳黃酮K-R試液，使其中醋柳黃酮原料的含量為 100 μg/mL，乙醇含量為 2%，Cremophor ELP含量為0.5%，于37℃恒溫電熱水浴鍋中放置5 h，分別于0、1、2、3、4、5 h 時(shí)取樣測(cè)定醋柳黃酮的含量(以槲皮素和異鼠李素的總和計(jì))。

分別計(jì)算不同pH的空白K-R試液所配制的醋柳黃酮溶液的降解速率常數(shù)Ka(見(jiàn)表2)，以降解速率常數(shù)的對(duì)數(shù)(表示為L(zhǎng)nKa)對(duì)pH作圖，繪制pH-降解速率曲線，考察pH對(duì)醋柳黃酮溶液穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同pH值空白K-R試液中醋柳黃酮的pH-降解速率曲線

表2 空白K-R試液pH對(duì)穩(wěn)定性的影響

由圖2可見(jiàn)，醋柳黃酮溶液的降解反應(yīng)速率受空白K-R試液pH值的影響較大，屬于酸堿催化反應(yīng)。結(jié)合表2，可知醋柳黃酮在堿性條件下穩(wěn)定性較差，而在酸性條件下穩(wěn)定性較好。

2.2.3 調(diào)節(jié)醋柳黃酮K-R試液pH后的穩(wěn)定性

分別取適量空白K-R試液，加入醋柳黃酮乙醇濃配液以及Cremophor ELP，配制醋柳黃酮K-R試液，使其中的醋柳黃酮原料的含量為100 μg/mL，乙醇含量為2%，Cremophor ELP含量為0.5%，用1 mol/L NaOH及1 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至5.4、6.8、7.4、7.8、7.9，于 37 ℃恒溫電熱水浴鍋中放置5 h，分別于 0、1、2、3、4、5 h 時(shí)取樣測(cè)定醋柳黃酮的含量(以槲皮素和異鼠李素的總和計(jì))。

分別計(jì)算醋柳黃酮K-R試液在不同pH值下的降解速率常數(shù)Ka(見(jiàn)表3)，以LnKa對(duì)pH作圖，繪制pH-降解速率曲線，考察pH對(duì)醋柳黃酮K-R試液穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 醋柳黃酮K-R試液在不同pH值的pH-降解速率曲線

表3 醋柳黃酮K-R試液pH對(duì)其穩(wěn)定性的影響

結(jié)合圖2、圖3及表2，表3可知，直接調(diào)節(jié)醋柳黃酮K-R試液的pH對(duì)其穩(wěn)定性的影響明顯好于調(diào)節(jié)空白K-R試液的pH值，因此選擇直接調(diào)節(jié)醋柳黃酮K-R試液的pH值來(lái)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。由于小腸pH在6～7之間，pH5.4偏酸，因此不予考慮。而在pH7.8及7.9下醋柳黃酮K-R試液不穩(wěn)定，也不予考慮。綜合以上結(jié)果，選擇調(diào)節(jié)醋柳黃酮K-R試液pH值至6.8及7.4進(jìn)行深入考察。

2.2.4 時(shí)間對(duì)醋柳黃酮穩(wěn)定性的影響

分別取適量空白K-R試液，加入醋柳黃酮乙醇濃配液以及Cremophor ELP，配制醋柳黃酮K-R試液，使其中醋柳黃酮原料的含量為100 μg/mL，乙醇含量為2%，Cremophor ELP含量為0.5%，用1 mol/L NaOH及1 mol/L HCl調(diào) pH 值至6.8、7.4，于37℃恒溫電熱水浴鍋中放置 5 h，分別于 0、1、2、3、4、5 h時(shí)取樣測(cè)定醋柳黃酮的含量(以槲皮素和異鼠李素的總和計(jì))。

分別計(jì)算醋柳黃酮K-R試液在pH值6.8及7.4下的不同時(shí)刻剩余濃度百分比(C不同時(shí)刻/C0h×100%，見(jiàn)表4)，以剩余濃度百分比(%)對(duì)時(shí)間(h)作圖(見(jiàn)圖4)，并計(jì)算RSD值，考察其穩(wěn)定性。

根據(jù)，醋柳黃酮K-R試液在pH6.8和pH7.4下剩余濃度百分比可知，將醋柳黃酮K-R試液pH值調(diào)節(jié)至6.8時(shí)，37℃水浴放置5 h，醋柳黃酮K-R試液仍然穩(wěn)定，而將醋柳黃酮K-R試液pH值調(diào)節(jié)至7.4時(shí)，37℃水浴放置2 h穩(wěn)定，5 h則逐漸降解，穩(wěn)定性較差。

表4 pH值為6.8及7.4時(shí)醋柳黃酮K-R試液的穩(wěn)定性(n=3)

圖4 醋柳黃酮K-R試液(pH6.8和7.4)的穩(wěn)定性

綜上所述，可以將醋柳黃酮K-R試液的pH值調(diào)至6.8進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3 討論

3.1 預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，醋柳黃酮在腸營(yíng)養(yǎng)液(K-R試液)中不穩(wěn)定，而這種不穩(wěn)定性可能與溶液的pH有關(guān)，因此本文系統(tǒng)地研究pH對(duì)醋柳黃酮穩(wěn)定性的影響，以確保醋柳黃酮腸吸收試驗(yàn)的順利進(jìn)行。

3.2 由于小腸的pH通常為6～7，一般考察藥物在體腸吸收時(shí)選擇腸循環(huán)液 pH6.8、7.4、5.4、7.8、7.9［3-5］，首先調(diào)節(jié)空白K-R試液的pH值并配制醋柳黃酮K-R試液，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)37℃水浴5 h后前后濃度變化較大，若改為直接調(diào)節(jié)醋柳黃酮K-R試液的pH值，醋柳黃酮的穩(wěn)定性有明顯好轉(zhuǎn)，可能是由于醋柳黃酮中有效成分本身顯弱酸性，加入之后會(huì)使K-R試液的pH發(fā)生改變，因此選擇直接調(diào)節(jié)醋柳黃酮K-R試液的pH值。

3.3 有文獻(xiàn)報(bào)道［6］醋柳黃酮在pH值較高條件下長(zhǎng)時(shí)間放置其結(jié)構(gòu)可發(fā)生不可逆的變化，從而影響其穩(wěn)定性，本試驗(yàn)結(jié)果也得到相同的結(jié)論:醋柳黃酮在堿性溶液中穩(wěn)定性較差，而在酸性溶液中穩(wěn)定性較好。此外根據(jù)小腸的pH值選擇直接調(diào)節(jié)醋柳黃酮K-R試液的pH值至6.8及7.4，考察其穩(wěn)定性，由結(jié)果可知調(diào)節(jié)醋柳黃酮K-R試液的pH值至6.8時(shí)溶液穩(wěn)定，而調(diào)節(jié)醋柳黃酮K-R試液的pH值至7.4時(shí)溶液穩(wěn)定性較差。綜上可知，需調(diào)節(jié)醋柳黃酮K-R試液的pH值至6.8，可確保醋柳黃酮在體腸循環(huán)試驗(yàn)的順利進(jìn)行。

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