絡必通顆粒對DPN大鼠神經電生理及Na+，K+-ATP酶活性的影響

馬 麗， 胡曉靈

(新疆醫科大學附屬中醫醫院，新疆烏魯木齊830000)

糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy DPN)是因糖尿病慢性高血糖狀態及其所致各種病理生理改變而導致的神經系統損傷，可累及全身神經系統任何部分，是糖尿病最常見和最復雜的并發癥，累及超過50%的糖尿病患者［1］可以出現DPN。DPN的發病機理主要涉及代謝障礙和血管障礙兩方面。在臨床上DPN的癥狀很難處理，目前尚缺乏有效的治療方法，多數藥物的臨床效果還有待進一步證實，中醫藥在治療慢性疾病中有確切的優勢，研究臨床療效可靠的中藥治療DPN，具有非常重要的實際意義。

由于糖尿病的高血糖狀態，脂蛋白易發生糖基化，糖化血紅蛋白不易被血液清除而沉積于血管壁，促進動脈硬化形成。而且多元醇通路活性增高，使神經細胞高滲腫脹變形，周圍神經出現髓鞘分離、脫失，并影響肌醇和?；撬岽x，減少 NO 合成，導致神經 Na+，K+－ATP 酶活性的降低［2］，致細胞結構和功能損壞。本實驗以血糖、糖化血紅蛋白、神經電生理、Na+，k+－ATP酶等指標，驗證絡必通顆粒對DM大鼠周圍神經病變的治療作用。

材料與方法

1 材料

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，♀♂各半，體重(150±20)g，150只，由新疆醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證:新醫動字SLXK(新)2003－0001?！狻岽笫蠓謩e分籠飼養，每籠飼養5只，室溫(23±2)°C，相對濕度50% ～60%，通風良好，自由攝食、飲水。

1.2 實驗藥物

絡必通顆粒，由新疆醫科大學附屬中醫醫院研制，批號(0504202224);糖脈康顆粒，中國中醫研究院中匯制藥公司生產，批號:(050802)。

1.3 主要試劑(略)、主要儀器(略)

2 方法

2.1 動物造模

2.1.1 2型糖尿病模型建立［3］

首先選擇合格大鼠，♀♂各半，體重(150±20)g，模型組大鼠喂以高脂飼料(其中含70%碳水化合物、20%蔗糖，10%豬油)連續兩個月，誘發出胰島素抵抗;繼以小劑量STZ 35 mg/kg(鏈脲佐菌素溶于0.1 mol/L，pH4.5的檸檬酸緩沖液，STZ配制為1%的溶液)，于大鼠禁食14 h后腹腔注射;然后繼續高糖高脂飼料喂養4周，用葡萄糖氧化酶法及放射免疫法測空腹血糖及胰島素水平，并據公式求出胰島素敏感指數(insulin sensitivity index ISI)。每周測定大鼠的體重、飲水量和進食量。空白對照組予以正常飲食并給予檸檬酸緩沖液平行進行實驗。空白組和模型組動物分籠飼養，自由進食和飲水。

2.1.2 2型糖尿病周圍神經病變模型建立

在上述模型基礎上持續觀察8周，用肌電圖儀分別采用在體直接和間接的測定方法［4］，測定動物坐骨神經傳導速度及尾神經傳導速度［5］。判定糖尿病周圍神經病變模型的確立。

2.2 分組與給藥

將模型鼠按隨機數字表法隨機分為5組，分別為模型組、陽性對照組(糖脈康組)、絡必通治療組(包括小、中、大劑量)。絡必通顆粒為1.17，2.34，4.68 g/kg 3個劑量每日灌胃;陽性對照組予以糖脈康1.56g/kg灌胃;模型組、正常對照組均灌以相應容積的蒸餾水，每日1次，正常飲食，用藥共計8周。

2.3 Na+，K+－ATP 酶活性的測定方法

用藥8周后，取大鼠右側坐骨神經，并準確稱取坐骨神經的重量，按重量體積比加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，1 000～3 000 r/min，離心10 min，然后取組織勻漿上清再以生理鹽水按1∶9稀釋成1%組織勻漿，用于測定組織蛋白。

采用商品試劑盒，按照試劑說明在722分光光度計上進行測定。ATP酶可分解ATP生成ADP及無機磷，通過測定無機磷的量可判斷ATP酶活性的大小。將每小時每毫克組織蛋白的ATP酶分解ATP產生1 μmol/L無機磷的量定義為一個ATP酶活性單位。計算公式如下:

組織中 Na+，K+－ATPase活力(U/mgprot)= ［(測定管OD值－對照管OD值)/(標準管OD值－空白管OD值)］×標準管濃度(0.02 μmol/mL)×6×7.8÷勻漿蛋白濃度(mgprot/mL)

2.4 統計學處理

用SPSS13.0統計軟件處理。各組實驗數據以均數±標準差表示，并對變量進行方差齊性檢驗，方差齊性齊時，兩組比較用兩樣本均數t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。方差不齊時用非參數 t檢驗(Kolmo－gorov－Smirnov檢驗或Kruskal－Wallis檢驗)。檢驗水準定為α=0.05。

結 果

1 DPN模型(坐骨神經與尾神經肌電圖結果)

兩組動物在第20周測定坐骨神經運動神經傳導速度和潛伏期及尾神經感覺神經傳導速度和潛伏期，確定DPN動物模型成立，共計89例。結果顯示:兩種方法測出的坐骨神經MNCV均減慢，尾神經SNCV較正常組減慢，差異有統計學意義(P＜0.05)。在體直接法潛伏期較正常組延長且差異有統計學意義(P＜0.05)。而在體間接法所測MNCV潛伏期和尾神經較正常組雖延長，但差異無統計學意義(P＞0.05)。依據神經傳導速度判定DPN動物模型建立成功。(表1、2)。因方差齊，兩組比較采用t檢驗。

表1 坐骨神經肌電圖兩組比較(±s)

表1 坐骨神經肌電圖兩組比較(±s)

MNCV/(m/s間接法分組 樣本數/個潛伏期/s直接法MNCV/(m/s)直接法潛伏期/s間接法正常組 20 0.92±0.16 42.74±6.99 1.83±0.17 48.73±8.68模型組 89 1.09±0.27 33.41±7.01 1.98±0.34 35.80±6.20

表2 尾神經肌電圖兩組比較(±s)

表2 尾神經肌電圖兩組比較(±s)

分組 樣本數/個 潛伏期/s SNCV/(m/s)正常組20 2.53±0.45 48.99±5.16模型組89 2.72±0.50 44.00±7.07

2 絡必通顆粒對DPN大鼠肌電圖的影響

2.1 絡必通顆粒對DPN大鼠坐骨神經肌電圖的影響

造模20周，DPN大鼠模型成立共計89例，隨機分配至5組，經藥物治療8周后，DPN大鼠死亡18只，正常對照組死亡2只。結果:DPN大鼠經藥物治療，各給藥組大鼠運動神經傳導速度較模型組有明顯的加快，其中絡必通大中劑量組提高更明顯，優于陽性藥物組，且差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 絡必通顆粒對坐骨神經肌電圖的影響(±s)

表3 絡必通顆粒對坐骨神經肌電圖的影響(±s)

分組 樣本數/個/s正常對照組 18 45.83±5.04 1.13±0.14 52.20±2.85 2.72±0.47直接法MNCV/(m/s) 潛伏期/s間接法MNCV/(m/s) 潛伏期模型組 16 31.65±3.73 1.51±0.22 32.65±5.23 2.68±0.48陽性藥物組 13 37.13±3.16 1.32±0.12 43.85±3.96 2.66±0.47絡必通小劑量 14 38.11±2.70 1.21±0.13 42.61±4.30 3.07±0.46絡必通中劑量 13 40.56±3.26 1.16±0.96 48.26±4.38 2.89±0.50絡必通大劑量 15 42.76±3.88 1.16±0.10 47.94±3.85 2.55±0.35

2.2 絡必通對DPN大鼠尾神經肌電圖的影響

各給藥組大鼠經治療，SNCV均較模型組有所提高，其中絡必通大劑量組與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 絡必通對尾神經肌電圖的影響(±s)

表4 絡必通對尾神經肌電圖的影響(±s)

18 37.28±5.56 3.39±0.57模型組 16 31.41±2.41 3.67±0.42陽性藥物組 13 34.13±3.38 3.54±0.47絡必通小劑量 14 35.25±3.67 3.19±0.45絡必通中劑量 13 33.72±4.39 3.55±0.53絡必通大劑量/s正常組分組 樣本數/個 SNCV/(cm/s) 潛伏期15 35.22±2.83 3.49±0.43

3 絡必通顆粒對DPN大鼠糖化血紅蛋白及Na+，K+-ATP酶活性的影響

實驗動物經肌電圖檢測時需腹腔注射氯胺酮20 mg/kg麻醉，肌電圖檢測結束后，死亡14只，最終樣本數見表5，6。模型組大鼠HbA1C較正常組明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05);各治療組均可降低HbA1C;絡必通大劑量組與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。模型組大鼠Na+，K+－ATP酶活性比正常組明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05);各治療組均可延緩Na+，K+－ATP酶活性的降低，絡必通中、大劑量，陽性藥物與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。(見表 5、6)

討 論

1 絡必通顆粒對血糖、糖化血紅蛋白的影響

糖尿病時，糖化血紅蛋白增多，其與氧的親和力增加，而不易釋放氧，造成局部組織細胞的長期缺氧，這是產生糖尿病神經病變的病理生理基礎。此外，蛋白質的非酶糖化可涉及許多血漿和組織蛋白，導致蛋白變性，糖化蛋白的產生可引起神經髓鞘和組織結構的損傷改變，減弱神經組織的再生修復能力，髓鞘質糖化可引起神經髓鞘分離脫失，軸索微管蛋白糖化使其傳導功能障礙，這些改變最終導致了糖尿病慢性并發癥如DPN的發生。實驗結果顯示模型組大鼠血糖顯著升高，糖化血紅蛋白含量顯著增加，應用絡必通顆粒后，對DPN大鼠的糖化血紅蛋白濃度有降低作用，與模型組比較有統計學差異，提示絡必通顆?？赡芡ㄟ^降低血糖的途徑，減少血糖與蛋白質之間的反應，抑制蛋白糖化后的各種病理反應，減少蛋白質的功能異常，達到治療DPN的作用。積極控制血糖是治療糖尿病及其并發癥的一項基礎措施。

表5 各組大鼠糖化血紅蛋白比較(±s)

表5 各組大鼠糖化血紅蛋白比較(±s)

分組 樣本/個 糖化血紅蛋白/(HbA1C )17 16.63±2.55模型組 10 27.11±5.24*陽性藥物組 13 25.04±4.07絡必通小劑量 13 24.14±4.68絡必通中劑量 9 23.58±5.63絡必通大劑量 13 23.29±2.25正常對照組△

表6 各組大鼠Na+，K+-ATP酶活性比較(±s)

表6 各組大鼠Na+，K+-ATP酶活性比較(±s)

分組 樣本/個 Na+，K+－ATP酶活性/(U/mg)17 55.92±13.71模型組 10 28.24±10.41*陽性藥物組 13 46.79±13.67△絡必通小劑量 13 39.02±10.99絡必通中劑量 9 47.36±14.16△絡必通大劑量 13 48.05±6.36正常對照組△

2 絡必通顆粒對神經電生理的影響

寧光［6］對301例糖尿病患者進行神經傳導檢查結果表明，相對臨床一般檢查，無論是運動神經傳導速度，還是感覺神經傳導速度，其異常率都要高于臨床一般檢查結果，可以在這些糖尿病患者中早期發現臨床無異常的神經損傷，從而達到早期診斷目的。近期國外學者［7］進一步肯定了神經傳導檢查、感覺定量測定，這兩種神經電生理檢查方式的良好可重復性以及在DPN臨床試驗中的應用前景。因此將神經電生理的改變作為DPN大鼠模型成立以及療效判定是目前動物實驗較經典的指標。本試驗中具有益氣養陰、活血祛瘀、解毒化濁功效的絡必通顆粒在所觀察的8周內可使模型大鼠已減慢的神經傳導速度加快，提示絡必通顆粒對糖尿病大鼠周圍神經功能有明顯的改善作用。其中醫機理可能是益氣養陰、活血祛瘀、解毒化濁法聯合運用而達氣陰得充，中焦得助，消渴得除，瘀濁邪毒得祛，經脈得養而通暢，從而受損的神經得以津血的濡養而功能恢復，神經傳導速度加快，且絡必通顆粒中多種中藥均有降糖、降脂和改善多元醇通路狀態的作用，從而機體的代謝和微循環得以改善，傳導速度提高。

3 絡必通顆粒對Na+，K+-ATP活性的影響

Na+，K+－ATP酶是生物體內廣泛存在的一種極為重要的膜酶，廣泛分布于各類細胞質膜上，它與神經肌肉興奮性和傳導性的保持，物質吸收和腺體的分泌等生理過程密切相關。Na+，K+－ATP酶活性的減小可反映出能量代謝的改變，影響到細胞能量釋放，導致細胞內外離子濃度差的減小，引起NCV減慢。在實驗性糖尿病動物中觀察到［2］，大鼠坐骨神經Na+，K+－ATP酶活性明顯下降，表明糖尿病狀態下，動物外周神經細胞Na+、K+的轉運和能量供應可能產生障礙，糖尿病時的多元醇通路增強可以通過影響肌醇和?；撬岽x，減少NO合成，引起偽缺血等多種途徑，導致神經Na+，K+，ATP酶活性的降低。Bianchi等［8］的研究表明，在鏈脲佐菌素誘導后11周的糖尿病大鼠坐骨神經中Na+，K+－ATP活性明顯降低，與本文的結果相一致。本實驗中，絡必通治療組增加Na+，K+－ATP酶的活性，且大劑量組效果明顯，顯示出具有增強神經功能的作用。分析原因，糖代謝的改善是基礎治療，對于控制糖尿病及并發癥意義明確。微循環的改善有利于Na+，K+－ATP酶活性的恢復。同時這一作用可能還與絡必通顆粒降低神經組織中多元醇含量，抑制醛糖還原酶活性等有關，這有待于今后的基礎實驗進一步證實。

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