組織工程骨修復骨不連研究進展

趙福江，王云亭

（中日友好醫院 骨科，北京 100029）

組織工程骨修復骨不連研究進展

趙福江，王云亭?

（中日友好醫院 骨科，北京 100029）

骨不連是骨折常見并發癥。美國每年發生的約600萬骨折患者中，約5%～10%發生骨不連[1]。骨不連的治療措施多種多樣，自體骨移植是目前臨床上治療骨不連的主要方法。但該方法存在一些缺陷，并可帶來一些并發癥，不利于其在臨床上的廣泛使用[2]。用組織工程骨替代自體骨移植來促進骨生成是近年來研究的熱點。現就組織工程骨修復骨不連的研究進展情況做一綜述如下。

1 骨不連

1.1 骨不連概述

骨不連是指骨折后未形成骨連接，骨愈合過程停止。對于診斷骨不連的確切時間沒有明確的定義，美國食品與藥品管理局（FDA）將其定義為9個月[3]。根據X線表現，骨不連可以分為萎縮型和肥大型骨不連兩種類型。肥大型骨不連骨折端有充分的血供[4]，萎縮型骨不連主要是由于骨折端血運缺乏所致，成骨能力下降[5]。

1.2 骨不連的病因

引起骨不連的原因很多，主要包括全身因素和局部因素。全身因素包括營養不良，糖尿病，吸煙，骨質疏松以及非甾體類抗炎藥的使用；局部因素包括局部感染，血運缺乏，骨折端固定不牢固，骨折端接觸不充分以及高能量損傷等[6]。影響骨折愈合的根本因素在于骨折局部的血液供應。Reed等[7，8]研究發現萎縮型骨不連患者和肥大型骨不連患者骨折處的血管計數基本相同，并通過動物試驗發現萎縮型骨不連骨折處血運在早期明顯減少，3周時開始增多，到第8周時和肥大型骨不連處血管計數基本相同。因此，Reed認為血運不足是引起骨不連的主要原因。后期雖然血運恢復，但骨愈合過程已停止，骨不連繼續存在[7]。

1.3 骨不連目前的治療方法及存在的缺陷

骨不連目前主要的治療主要包括牢固的固定和自體骨移植。自體骨移植包括了骨修復所有的核心因素：（1）骨引導作用的三維支架；（2）骨誘導作用的生長因子；（3）成骨作用的細胞[9]。自體骨移植治療骨不連治愈率較高，但是在取得良好效果的同時也伴隨著一些不利因素，限制了骨移植治療的廣泛使用[2]。自體骨移植來源有限，尤其是在伴有較大的骨缺損或者缺損形態不規則的時候，自體骨移植很難提供充足及合適的骨。而且自體骨移植還可能帶來很多并發癥：自體骨移植需行手術從患者體內取骨，對患者造較大的創傷；還可能造成傷口感染，術后供骨區持續疼痛及傷口處血腫等，給患者帶來很大痛苦。這些不利因素都不利于自體骨移植的廣泛使用。同種異體骨來源也有限，且有傳播肝炎和艾滋病等傳染病的危險，而且牽涉倫理問題。異種骨移植雖然來源廣泛，但免疫排斥反應嚴重，成骨能力較差[10]。為了克服骨移植在治療骨不連中的缺陷，很多專家學者開始尋找骨移植的替代治療。

2 骨組織工程在治療骨不連中的作用

2.1 骨組織工程概述

骨組織工程是將患者或供者的特定細胞（干細胞、祖細胞）在體外支架材料上生長，形成一個三維結構，然后移植到患者體內[11]。移植后，細胞分化并轉移到支架內部，血管附上并蔓延到新組織內部，然后生成骨組織。骨組織工程的最終目的是將支架材料在體內誘導成骨樣結構，從而取代缺損或病變的骨組織[11]。

2.2 血管化在骨組織工程中的作用

骨折愈合是一個復雜的過程，要求各種細胞的活化、遷移、分化成熟，合成細胞外基質和各種形態結構[12]。因此血管生成過程是早期創傷和骨折愈合過程中的關鍵因素，并且是充足的氧氣和營養物質供應，以及引導炎性細胞到達創傷部位最重要的因素[4]。移植后生物材料成功引導骨生成依賴于能發揮生物活性的細胞[13]。該過程中，骨細胞長入支架內部及生物材料內部血管生成必須同時發生。血管的生長范圍決定新生骨生成情況。骨的生長需要血管網絡提供營養物質，帶走代謝產物。但礦化骨不能通過滲透和擴散作用提供營養，血管只能在100μm以內提供營養，100μm外的各種細胞因得不到充足營養不能存活[14]。因此，在組織工程骨治療骨不連過程中，提高組織工程骨的血管化水平成為移植成功的關鍵。

2.3 種子細胞

隨著干細胞與組織工程技術的進步，對骨組織工程的認識更加深入。許多文獻報道成功的骨移植材料需要提供骨折愈合的三個核心要素：骨引導作用的支架材料，骨誘導作用的生長因子以及成骨細胞[13]。而骨引導與骨誘導作用的發揮依賴于成骨細胞的作用[9]。對種子細胞的研究也從單純間充質細胞過渡到成骨細胞和血管內皮細胞。

2.3.1 間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）

MSCs是存在于骨髓中非造血干細胞的另一種干細胞，是由中胚層發育的早期細胞，具有多向分化潛能，不僅能分化為造血實質支持造血，還可以分化為多種造血以外的組織細胞，特別是中胚層和神經外胚層來源的組織細胞，如骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、肝細胞、脂肪細胞等[16]。目前已有研究表明MSCs可以分化為成骨細胞，并已通過特定的條件在體外成功誘導分化出成骨細胞[17]。骨折的愈合主要包括膜內成骨和軟骨內成骨兩個過程。膜內成骨是MSCs增殖分化為成骨細胞，由成骨細胞生成骨組織；軟骨內成骨是MSCs分化為軟骨細胞，形成軟骨，再通過一系列重塑過程形成骨組織。因此，MSCs是具有成骨潛力的細胞，骨愈合過程離不開MSCs的參與[12]。在當前的骨組織學研究中，大量學者使用MSCs做為種子細胞與支架材料結合研究骨生成情況。有學者將載有MSCs的三維支架移植到經免疫抑制的小鼠皮下，發現有新骨組織生成[18]。

將MSCs作為種子細胞的組織工程骨用于治療骨不連，無法解決三維支架內部血運缺乏的問題。由于三維支架內血管缺乏，將負載MSCs的三維支架材料移植到動物體內后，大量MSCs因無法獲得足夠的氧氣與營養物質而壞死[19]，數量減少。此外，MSCs需轉化為成骨細胞才能發揮成骨作用，而人體內MSCs數量有限，且只有很小一部分能轉化為成骨系細胞發揮成骨作用[20]。鑒于以上不足，一些學者開始考慮使用具有直接成骨作用的成骨細胞及有成血管作用的內皮細胞聯合來治療骨不連[19，21]。

2.3.2 成骨細胞

在骨折愈合及骨骼發育過程中，新骨的生成是一個復雜、多階段的過程，包括一系列的生物反應。在第一階段，成骨細胞或其祖細胞從周圍的組織及血液循環中募集到將要發生骨生成的部位[22]。到達特定部位后，細胞增殖分化為成熟的功能成骨細胞，產生細胞外基質，形成骨。因此，成骨細胞或其祖細胞聚集到骨折部位是新骨生成的基礎[23]。骨不連，尤其是萎縮型骨不連患者，由于缺乏血供，成骨細胞及其祖細胞無法正常到達骨折部位，使正常骨折愈合過程無法繼續進行。如果將成骨細胞作為組織工程的種子細胞，移植到骨不連處，成骨細胞即可在原位分泌細胞外基質，促進骨不連愈合。使用成骨細胞避免了從MSCs分化為成骨細胞的過程，從而縮短了骨愈合的時間，并可保證成骨細胞的數量。當前體外誘導分化成骨細胞的技術已經比較成熟，已有很多學者將骨髓間充質細胞經體外誘導分化為成骨細胞[17]。

2.3.3 內皮細胞

骨組織成功移植需要許多復雜的過程。首先發生急性炎癥反應，隨后的修復過程導致骨折愈合。在這個過程中，骨細胞和血管必須同時長入支架材料。內皮細胞是這些過程中主要的細胞。它參加炎性反應過程，并通過分泌炎性因子和表達細胞粘附分子參與骨修復過程[24]。除此之外，內皮細胞還構成了血管的內壁[21]。內皮細胞在血管生成刺激物，比如1型膠原、VEGF、和bFGF的作用下，在體外可以生成管腔樣結構[24]。內皮細胞可以從人臍靜脈中得到，并通過體外培養得到擴充。但通過這種途徑獲得內皮細胞來源有限。現在，人們發現MSCs具有分化成內皮細胞的潛能。MSCs來源廣泛，已有學者通過在體外利用血管內皮細胞生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）、纖維素樣生長因子-B（fibroblast growth factor-B，b-FGF）成功將MSCs誘導成內皮細胞[25]。

2.3.4 內皮細胞與成骨細胞聯合作為種子細胞

由于上述內皮細胞的成血管作用和成骨細胞的成骨作用，將兩者聯合作為種子細胞有望成為治療骨不連一種新的方法[14]。包含內皮細胞和成骨細胞的三維支架，在植入體內前經過一段時間的體外誘導，生成血管[21]。植入體內后，這些血管就可發揮功能，帶來氧氣及營養物質，使成骨細胞充分發揮成骨作用，從而有利于骨折愈合，克服了將成骨細胞單獨作為種子細胞的缺陷。另外，這兩種細胞除了各自的成骨和成血管作用以外，還具有相互促進的作用[26～29]。

研究表明，血管內皮細胞可以分泌一些細胞因子影響成骨細胞的功能和分化，而成骨細胞除表達這些細胞因子的受體外還可以分泌細胞因子影響內皮細胞的功能[26]。血管內皮細胞可以分泌骨形態蛋白 （bone morphogenic proteins，BMPs）及內皮素-1（endothelin-1，ET-1）等細胞生長因子[27]。BMP是作用最強的骨誘導蛋白：BMP能促進成骨細胞的趨化作用，BMP-2能誘導骨髓間充質祖細胞誘導分化為成骨細胞[28，29]。ET-1能夠誘導成骨細胞增殖和分化，并能夠促進成骨細胞堿性磷酸酶的表達和?型膠原的生成[25]。內皮細胞通過這兩種作用提高成骨細胞的成骨能力。除此之外，成骨細胞可以分泌VEGF[30]。VEGF能夠促進MSCs誘導分化為內皮細胞，并使內皮細胞生成血管[25]。Unger等[21]將內皮細胞與成骨細胞在體外聯合培養，在不加任何生長因子的情況下見到管腔樣結構和骨樣組織生成。而將兩者單獨培養，則基本上沒有管腔結構，且僅有少量骨組織生成。張建等[31]發現內皮細胞和成骨細胞聯合作為種子細胞修復下頜骨缺損時，無論是促進骨生成還是促進血管生成的效果都要明顯高于單純成骨細胞。

3 組織工程骨治療骨不連的現狀及展望

目前，組織工程骨的研究以及在臨床上的使用已經取得了一定的成果。Kruyt等[32]使用BMSCs做為種子細胞植入山羊的脊柱間發現了明顯的成骨反應；Kitoh等[17]在施行3例骨延長手術時，將BMSCs配合富含血小板的血漿注入牽拉成骨的部位，發現可以明顯提高成骨的速度；Yu等[14]將MSCs誘導為血管內皮細胞和成骨細胞，然后將兩種細胞聯合培養，得到血管化的組織工程骨，植入動物體內后，發現其成骨作用較單純使用成骨細胞有明顯提高。Gan等[15]利用患者自體骨髓細胞進行離心濃縮后，將得到的MSCs與β-三磷酸鈣混合后用用于脊柱融合，取得了較好的效果。楊志明等[33]應用自體BMSCs對52例患者多個部位的骨缺損、骨不愈合進行修復，初步證實：①組織工程骨具有良好的成骨能力和修復效果；②采用同種異體來源的成骨細胞未發現明顯組織排斥反應及其他并發癥。

但是，目前組織工程骨的應用還存在一些問題：種子細胞往往需要體外培養或誘導達到一定的數量后，才能在體內發揮最大的作用，而體外環境無法完全模擬體內環境，因此，種子細胞的安全性問題需要我們更進一步的研究[34]。此外，進行不同類型組織工程骨構建研究，以及具有活力的血管化組織工程骨的構建，是組織工程臨床應用所必須解決的關鍵技術問題[35]。

骨組織工程的臨床應用尚處于起步階段，距離廣泛的臨床應用還有很長的路要走。隨著組織工程越來越受到廣大學者的關注，相信不久的將來，組織工程在基礎研究及臨床使用上將會取得突破性的成果。

[1]Borrelli JJr，Priekett WD，Ricci WM.Treatment of nonunions and osseous defects with bone graft and calcium sulfate[J].Clin Orthop Relat Res，2003（411）：245-254.

[2]Rotter N，Haisch A，Bucheler M.Cartilage and bone tissue engineering for reconstructive head and neck surgery[J].Eur Arch Otorhinolaryngol，2005，262（7）：539-545.

[3]Phieffer LS，Goulet JA.Delayed unions of the tibia[J].J Bone Joint Surg Am，2006，88（1）：206-216.

[4]Hofmann A，RitzU，Hessann MH，etal.Cellviability，osteoblast differention，and gene expression are altered in human osteoblasts from hypertrophic fracture non-unions[J].Bone，2008，42（5）894-906.

[5]Panagiotis M.Classification of non-union[J].Injury，2005，36（2）：S30-S37.

[6]Venkatachalapathy P，Craig SR.Facrors contributing to nonunion of fractures[J].Current Orthopaedics，2007，21（4）：258-261.

[7]Reed AAC，Joyner CJ，Browiilow HC，et al.Human atrophic fracture non-unions are not avascular[J].Journal of Orthopaedic Reseach，2002，20（3）：593-599.

[8]Reed AAC，Joyner CJ，Isefuku S，et al.Vascularity in a new model of atrophic nonunion[J].Journal of bone and joint surgery，2003，85（4）：604-610.

[9]Montjovent MA，Burri N，Mark S.Fetal bone cells for tissue engineering[J].Bone，2004，35（6）：1323-1333.

[10]Zuninol JH，Bengochea M，Johnston J.Immunologic and osteogeneic properties of xenogeneic and allogeneic demineralized bone transplants[J].Cell Tissue Bank，2004，5 （3）：141-148.

[11]Mistry AS，Mikos AG.Tissue engineering strategies for bone regeneration[J].Adv Biochem Eng Biotechnol，2005，94：1-22.

[12]Wraighte PJ，Scammell BE.Principles of fracture healing[J].Surgerv，2006，24（6）：198-207.

[13]Caplan AI，Bruder SP.Mesenchymalstem cells：building blocksformolecularmedicine in the 21stcentury[J].Trends Mol Med，2001，7（6）：259-264.

[14]Yu H，VandeVord PJ，Mao L，et al.Improved tissue-engineered bone regeneration by endothelial cell mediated vascularization[J].Biomaterials，2009，30（4）：508-517.

[15]Gan YK，Dai K，Zhang P，et al.The clinical use of enriched bone marrow stem cells combined with porous beta-tricalcium phosphate in posterior spinal fusion[J].Biomaterials，2008，29（29）：3973-3982.

[16]Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science，1999，284（5）：143-147.

[17]Kitoh H，Kitakoji T，Tsuchiya H.Transplantation of marrowderived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma during distraction osteogenesis-a preliminary result of three cases[J].Bone，2004，35（4）：892-898.

[18]Mauney JR，Jaquiery C，Voladimir V，et al.In vitro evaluation of differentially demineralized cancellous bone scaffolds combined with human bone marrow stromal cells for tissue engineering[J].Biomaterials，2005，26（16）：3173-3185.

[19]Hisatome T，Yasunaga Y，Yanada S，et al.Neovascularization and bone regeneration by implantation of autologous bone marrow mononuclear cells[J].Biomaterials，2005，26 （22）：4550-4556.

[20]Logeart-Avramoglou D，Anagnostou F，Bizios R，et al.Engineering bone：challenges and obstacles[J].J Cell Mol Med，2005，9（1）：72-84.

[21]Unger R.E，Sartoris A，Peters K，et al.Tissue-like self-assembly in cocultures of endothelial cells and osteoblasts and theformation ofmicrocapollary-likestructureson three-dimensional porous biomaterials[J].Biomaterials，2007，28（27）：3965-3976.

[22]Nakasaki M，Yoshioka K，Miyamoto Y，et al.IGF-1 secreted by osteoblasts acts as potent chemotactic factor for osteoblasts[J].Bone，2008，43（5）：869-879.

[23]Tsiridis E，Upadhyay N，Giannoudis P.Molecular aspects of fracture healing：Which are the important molecules?[J].Injury Int J Care Injured，2007，38（S1）：S11-S25.

[24]Peters K，Schmidt H，Unger RE，et al.Software-supported image quantification of angiogenesis in an in vitro culture system：application to studies ofbiocompatibility[J].Biomatetials，2002，23（16）：3413-3419.

[25]Jazayeri M，Allameh A，Soleimani M，et al.Molecular and ultrastructural characterization of endothelial cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells[J].Cell Biology International，2008，32（10）：1183-1192.

[26]Veillette CJH，von Schroeder HP.Endothelin-1 down-regulates the expression of vascular endothelial growth factor-A associated with osteoprogenitor proliferation and differentiation[J].Bone，2004，34（2）：288-296.

[27]von Schroeder HP，Veillette CJ，Payandeh J，et al.Endothelin-1 promotes osteoprogenitor proliferation and differentiation in fetal rat calvarial cell culture[J].Bone，2003，33（4）：673-684.

[28]Marrnoy S，Bassilana F，Seuwen K，et al.Bone morphogenetic protein 2 induces placental growth factor in mesenchymal stem cells[J].Bone，2003，33（3）：426-433.

[29]Sotobori T，Ueda T，Myoui A，et al.Bone morphogenetic pro

tein-2 promotes the haptotactic migration of murine osteoblastic and osteosarcoma cells by enhancing incorporation of integrin β1 into lipid rafts[J].Experimental Cell Research，2006，312（19）：3927-3938.

[30]Wohlfart UM，Waltenberger J，Hausser H，et al.Vascular endothelial growth factor stimulates chemotactic migration of primary human osteoblasts[J].Bone，2002，30（3）：472-477.

[31]張健，胡敏，張文怡，等.復合血管內皮細胞組織工程骨修復兔下頜骨缺損的研究[J].北京口腔醫學，2008，16（5）：250-252.

[32]Kruyt MC，Wilson CE，Joost D.The effect of cell-based bone tissue engineering in a goat transverse process model[J].Biomaterials 2006，27（29）：5099-5106.

[33]楊志明，黃富國，秦廷武，等.生物衍生組織工程骨植骨的初步臨床應用 [J].中國修復重建外科雜志，2002，16（5）：311-314.

[34]Brown RQ，Mount A，Burg KJ.Evaluation of polymer scaffolds to be used in a composite injectable system for intervertebral disc tissue engineering[J].Biomed Mater Res A，2005，74（1）：32-39.

[35]Zakhary K，Motakis D，Hamdy RH，et al.Effect of recombinant human bone morphogenetic protein 7 on bone density during distraction osteogenesis of the rabbit mandible[J].O-tolaryngol，2005，34（6）： 407-414.

R68

A

1001-0025（2010）01-0051-03

10.3969/j.issn.1001-0025.2010.01.016

衛生部臨床學科重點項目[2007]353號；國家自然科學基金（30772194，30672117）。

*本文通訊作者。

趙福江（1981-），男，住院醫師，醫學碩士。

2009-08-04

2009-12-29