人臍帶間充質干細胞的特征及其臨床應用前景

徐若男 施 明 王福生 (解放軍第三○二醫院生物治療研究中心,北京100039)

1966年間充質干細胞首先由Friedenstein[1]從骨髓中發現,傳統理論認為這群細胞在特定誘導條件下可向中胚層細胞即骨、軟骨和脂肪細胞分化。然而越來越多的研究發現間充質干細胞具有向內、中、外三個胚層包括肌健、韌帶、肝細胞、心肌細胞和骨髓基質等分化發育的潛能[2]。骨髓來源的間充質干細胞易于培養、可大量擴增、遺傳背景相對穩定且多向分化特性不會受到影響[3],臨床上常被用于細胞(或組織)替代治療。但成人骨髓源間充質干細胞數量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降,且供者間充質干細胞的采集須行骨髓穿刺術,由于疾病的原因,病人常有感染、體質較弱等因素也限制了自體骨髓MSC移植的應用。因此尋找新的MSC來源是目前國內外干細胞研究的熱點。臍帶來源廣泛,便于取材,對供者無不利影響,無倫理道德問題的限制,且細胞增殖、分化能力較強,適合體外大規模培養。因此,臍帶MSC(Umbilical Cord-MSC)有望成為骨髓MSC的理想替代來源。正確分離臍帶間充質干細胞、鑒定其表型和功能、研究在疾病治療中的具體作用機制以及與其它免疫細胞之間的相互關系,對于深入認識臍帶間充質干細胞的特性、加速臨床應用進展具有非常重要的意義。ton's膠質和血管周圍組織中分離培養出了MSC,并建立了臍帶間充質干細胞的分離培養方法。常用的臍帶間充質干細胞體外分離方法主要包括植塊法和酶解法。依據選取消化酶的種類又可分為膠原酶消化、胰酶消化和兩種酶順序消化法。其中植塊法對細胞直接損傷小,原代培養細胞純度高,簡單、經濟,但所需培養時間長。酶解法獲得細胞數量大,培養時間短,但細胞純度略低,同時異源蛋白的引入會增加臨床應用過程中發生過敏反應的可能性。

就取材方便及對供者的影響而言,臍血和臍帶是較理想的MSC來源。關于臍血MSC的報道存在較多爭議,主要是其多系分化潛能較弱,會出現間充質干細胞表面標志SH-2、SH-3和SH-4表達缺失的現象。臍血分離的要求也較為嚴格,例如分離取材時間不得大于15個小時,體積不得少于33ml等,而細胞分離效果只為1/100萬,且分離成功率也僅為60%。同時臍血MSC的分離會損失臍血中造血干細胞。而臍帶來源廣泛,不影響胎兒臍帶血的保存,無道德倫理問題的限制,易于體外大量擴增,培養成功率高達100%。并且臍帶可望作為自體MSC來源和臍血共同移植,以提高臍血移植成功率。因此,臍帶MSC有望成為骨髓MSC的理想替代來源。

1 臍帶間充質干細胞的采集和優勢

目前間充質干細胞的主要來源為成人骨髓,但成人骨髓源間充質干細胞數量及增殖分化潛能隨年齡的增大而逐漸減弱,且病毒感染率較高、來源受到限制。因此尋找新的MSC來源顯得尤為重要。隨著間充質干細胞研究的不斷深入,已可從臍帶、臍帶血、骨骼肌細胞、脂肪、滑膜和肝臟等多種組織中分離得到間充質干細胞。2000年,Rrices[4]首次報道了臍帶血中可以分離培養出間充質干細胞,隨后Romanov等又分別從臍靜脈內皮和內皮下、臍帶Whar-

2 臍帶間充質干細胞的鑒定及功能研究

研究顯示MSC具有異質性,其表達的表面標志抗原較為復雜。如骨髓間充質干細胞可表達間質細胞、內皮細胞和表皮細胞的表面標志,主要包括:①粘附分子 ,如 CD166、CD54、CD102、CD44、CD106 等;②生長因子和細胞因子受體,如白介素1受體(IL-1R)、IL-3R、IL-4R、IL-6R、IL-7R、干擾素受體 、腫瘤壞死因子α等;③整合素家族成員,包括 CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104 等;④ 其它如 CD90、CD105等。許多研究表明不同組織來源的MSC同時又具有相似的免疫表型特征[5],表現為SH2(CD105)、SH3(CD73)、SH4 、CD166 、CD13 、CD29 、CD44等粘附分子陽性,不表達造血和內皮標記,如CD34、CD31和 CD45等。表達HLA-I,不表達HLA-DR,不表達協同刺激分子CD80、CD86和CD40。

胎兒組織來源的MSC分化程度更低,還可以表達其它動物如馬源的SSEA-1、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81和豬源的 Nanog,Oct-4、Sox-2、Rex-1 等分子 ,其比成人組織來源MSC具有更高的增殖能力和較弱的免疫調控能力。但與胚胎干細胞比較體外傳代后基因遺傳穩定性更強。骨髓MSC在體外培養8～15代或倍增25～40代后,增長停滯,開始分化過程,出現細胞變大、緊密連接消失、增殖速度減慢等現象,同時細胞表型和功能分析顯示細胞出現衰老現象。臍帶MSC擁有很多骨髓MSC的特點,例如成纖維樣形態、免疫表型、細胞周期狀態、以及脂肪和成骨分化潛能和促進造血的功能。但臍帶MSC形成CFU-F的能力要顯著優于骨髓MSC,增殖能力更強,脂肪分化能力更弱。此外,臍帶MSC細胞因子分泌譜除了表達骨髓MSC相關細胞因子外,還表達GM-CSF和G-CSF,并特異性表達人白細胞分化抗原HLA-G和神經膠質來源的神經營養因子GDNF[6]。

3 臍帶間充質干細胞在疾病治療中的作用及相關機制

間充質干細胞因其多潛能和可擴增性對再生醫學產生了不可估量的影響。在細胞治療、組織工程以及再生醫學領域內,間充質干細胞作為種子細胞可應用于修復/替代受傷或病變的多種組織器官,從而為目前一些無法有效治愈的重大疾病如脊髓受傷、多發性硬化(MS)、老年性癡呆、帕金森氏癥等提供了嶄新的治療方案。

除了間充質干細胞的可塑性外,MSC的免疫調節、免疫抑制功能尤其值得關注。其中骨髓MSC通過自我更新、多向分化和分泌多種效應因子如透明質酸等構建起穩定的造血微環境,在造血干細胞的生長、增殖、分化中發揮重要作用[7]。實驗性腦脊髓炎的動物試驗證明,MSC可以移入中樞神經系統,通過發揮免疫抑制功能,保護正常神經元的功能。對于眾多神經系統疾病而言,MSC發揮抗凋亡、抗炎癥的功能主要是招募、誘導局部組織中的前體細胞向神經元的分化,而并不依賴MSC自身向神經元的轉化。骨髓MSC治療缺血性心臟病(如心肌梗塞)、腦梗塞和脊髓損傷的研究證實,MSC能夠改善心臟和腦組織功能,主要機制是通過分泌SDF-1和VEGF等局部細胞因子,誘導微血管的生成,改善缺血組織微環境。體外試驗證實MSC能被誘導為心肌細胞,并表達肌鈣蛋白Ⅰ和肌間蛋白[8]。在鏈脲霉素誘導的小鼠糖尿病模型中,MSC可以加速胰島再生,促進腎小球腎炎的恢復。當MSC和骨髓細胞共同移植時,MSC可以有效抑制胰島β細胞特異性T細胞增殖,通過促進內源性胰島β細胞再生,恢復胰島功能,維持血糖水平穩定[9]。

臍帶MSC的臨床研究相對滯后,但目前的研究證實臍帶MSC作為滋養層細胞對胚胎干細胞的增殖分化同樣起到支撐作用,其分泌的神經營養因子GDNF有利于維持胚胎干細胞的未分化狀態。在條件性的神經元培養基內臍帶MSC可以被誘導為神經細胞,并表達神經元β-微管蛋白和星型膠質細胞蛋白GFAP[10]。Campard等[11]用肝細胞生長因子通過兩步法在體外有效地誘導出臍帶MSC向肝細胞的分化,被誘導的細胞在形態和分子標記物上都具有肝細胞特征。通過白蛋白和尿素分泌、糖元貯積、低密度脂蛋白攝取和細胞色素P450活化研究,進一步證明了人的臍帶間充質干細胞能夠被分化誘導成有功能的肝細胞。作為穩定、有效的基因載體,臍帶MSC介導的干擾素β靶向基因治療動物試驗顯示,臍帶MSC能夠攜帶靶基因定向進入癌癥組織,有效減少實體腫瘤體積[12]。

English等[13]對MSC抑制免疫排斥反應的機制研究證實,MSC可以從多層次對免疫反應進行調控。對T細胞、B細胞、DC細胞、NK細胞等的激活和增殖具有抑制作用。表現在:影響DC細胞的移位、成熟,降低T細胞對抗原的識別能力,與NK細胞表面的特定受體結合,誘導NK細胞的免疫耐受等。MSC發揮抗凋亡效應與抑制炎性因子IL-1β、TNF-α的產生密切相關。MSC進入機體優勢分布于受損部位,促進其功能恢復。但更多的機制表明MSC并沒有直接參與組織再生,而是為其它細胞的增殖分化提供良好的微環境。因此進入機體的間充質干細胞是否能定向進入機體受損部位、正常分化為組織細胞?是否會發生與器官移植相似的急性免疫排斥反應等問題就顯得尤為重要。

4 結語及展望

近年來,細胞(或組織)替代治療和基因治療是醫學領域乃至整個生命科學領域中的研究熱點和前沿,為人類征服多種疾病提供了希望。骨髓間充質干細胞相對容易分離培養、體外可大量擴增、遺傳背景相對穩定、體內植入反應弱,易于接受外源基因的導入和表達,而被認為是一種較為理想的組織工程和基因載體細胞。臍帶間充質干細胞的研究是傳統骨髓間充質干細胞的新生力量,與傳統的骨髓源MSC比較,臍帶源MSC的絕大多數生物學特征與骨髓源MSC相似,但在增殖能力、CFU-F頻率、CD106、HLA-Ⅰ表達和神經誘導分化能力等方面甚至要優于骨髓源MSC。同時臍帶來源廣泛,便于取材,對供者無不利影響,不影響臍帶造血干細胞的保存,無道德倫理問題的限制。因此,作為一種新型種子細胞,臍帶間充質干細胞的應用具有更廣闊的前景。

依據MSC的移植來源不同,有自體和異體之分。臨床上的某些危急時刻異體MSC更省事、省力。而某些亞急性狀態下,自體MSC更安全。就MSC的安全性而言,即使來源于自身免疫系統疾病患者的MSC也具有正常的表型和分子標記,體內環境下MSC抑制T細胞過度增殖功能的缺乏,并非是MSC自身免疫調節功能的異常,而是骨髓內微環境的紊亂。因此MSC發揮免疫功能的完整性更具有保證。

但目前間充質干細胞的研究仍存在迫切需要解決的問題。例如因組織來源、試劑使用、培養條件、血清使用、添加細胞因子種類、細胞培養密度等不同,造成不同實驗室的同一組織來源干細胞的細胞表型、起始細胞異質性、分化能力、增殖能力、長期培養后的細胞功能等存在較大差異,直接影響了間充質干細胞的應用[14]。因此,急需將間充質干細胞的取材、分離、培養和鑒定方法等標準化,研發新的試劑、鑒定表型標志和建立統一的原始細胞質控標準,從而加速間充質干細胞的研究。另外MSC的腫瘤原性也值得關注,一方面MSC通過轉化為腫瘤基質促進腫瘤生長;另一方面,MSC的免疫抑制功能也是其促腫瘤效應的必要條件。但最新的“touch and go”理論認為MSC進入機體后迅速移位于受損組織,隨后又很快被壓力誘導的“治療因子”所清除,因此應用中安全性較高。綜上所述,臍帶源MSC作為間充質干細胞的新生代表,在進一步完善其作用機制和臨床研究的基礎上,會擁有更為廣泛的應用前景。

1 Friedenstein A J,Piatetzky-shapiro II,Petrakova KV.Osteogenesis in transplants of bonemarrow cells[J].Embryol exp Morph,1966;16(3):581-390.

2 Pittenger M F,Mackay A M,Beck S C et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999;284(5411):143-147.

3 Jaiswal N,Haynesworth SE,Caplan AI etal.Osteogenic differentiation of purified,culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro[J].Cell Biochem,1997;64(2):295-312.

4 Rices A,Conget P,Minguell J J.Mesenchymal progenitic or cells in human umbilical cord blood[J].Br JHaematol,2000;109(1):235-242.

5 Minguelle J J,Erices A,Conget P.Mesenchymal stem cells[J].Exp BiolMed,2001;226(4):507-520.

6 Hoynowski SM,Fry MM,Gardner BM et al.Characterization and differentiation of equine umbilical cord-derived matrix cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006;362(2):347-353.

7 Guillot P V,ODonoghue K,Kurata H et al.Fetal stem cells:betwixt and between[J].Semin Reprod Med,2006;24(5):340-347.

8 Stamm C,Liebold A,Steinhoff G et al.Stem cell therapy for ischemic heart disease:beginning orend of the road?[J].Cell Transplant,2006;15(Suppl 1):S47-S56.

9 Urban V,Kiss J,Kovacs J et al.Mesenchymal stem cells cooperatewith bone marrow cells in therapy of diabetes[J].Stem Cells,2008;26(1):244-253.

10 Ma L,Feng X Y,Cui BL et al.Human umbilical cord Wharton's Jellyderived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells[J].Chin Med,2005;118(23):1987-1993.

11 Campard D,Philippe A,Lysy et al.Native Umbilical Cord Matrix Stem Cells Express Hepatic Markers and Differentiate Into Hepatocyte-like Cells[J].Gastroenterology,2008;134(3):833-848.

12 Rachakatla RS,Marini F,Weiss ML et al.Development of human umbilical cord matrixstem cell-based genetherapy for experimental lung tumors[J].Cancer Gene Ther,2007;14(10):828-835.

13 English K,Barry F P,Mahon B P.Murine mesenchymal stem cells suppress dendritic cell migration,maturation and antigen presentation[J].Immunol Lett,2008;115(1):50-58.

14 Sarugaser R,Lickorish D,Baksh D et al.Human umbilical cord perivascular(HUCPV)cells:a source of mesenchymal progenitors[J].Stem Cells,2005;23(2):220-229.