昆蟲抗寒性的研究進展

陳 豪, 梁革梅, 鄒朗云, 郭 芳, 吳孔明, 郭予元

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

受季節變化的影響,大多數昆蟲在生長發育過程中都要經受冬季低溫的制約。越冬是昆蟲抵御不良環境,完成生活史的一種生活對策。不同昆蟲有著不同的抗寒機制,且同種昆蟲的不同發育階段、不同個體的抗寒性也有很大差異。昆蟲抗寒性研究是昆蟲生態學和生物進化研究的熱點領域,也是害蟲預測預報和防治的理論基礎。本文從昆蟲越冬的主要蟲態、昆蟲對低溫的適應策略、抗寒機制及其與預測預報、綜合防治的關系等方面綜述了國內外關于昆蟲抗寒性及利用的進展。尤其是近些年開展的對昆蟲抗寒的生化、分子機制的研究,包括一些抗凍蛋白和熱激蛋白的基因、結構、功能的研究等,使得昆蟲的抗寒研究取得了突破進展,并使其抗寒理論得到進一步的完善。

1 昆蟲越冬的主要蟲態

昆蟲種類繁多,它們的越冬蟲態也呈現出多樣性。如亞洲玉米螟[Ostrinia f urnacalis(Guenée)]、高粱條螟[Chilo venosatus(Walker)]等以老熟幼蟲在秸稈中越冬,棉鈴蟲[Helicoverpa armigera(Hübner)]、煙青蟲[Helicoverpa assulta(Guenée)]等以蛹在土壤中越冬,綠盲蝽[Apolygus lucorum(Meyer-Dür)]、中黑盲蝽(Adelphocoris suturalis Jakovlev)等主要以卵在棉花枯枝鈴殼內或土壤中越冬。此外,有些昆蟲還可以以多種蟲態越冬,如螻蛄2～3年一代,以若蟲和成蟲兩種蟲態越冬,飛虱以卵和成蟲在禾本科雜草中越冬,甜菜象甲(Bothynoderes punctiventris Germar)以成蟲和幼蟲在土壤中越冬,葉蟬能以各種蟲態越冬[1-2]。

2 昆蟲對低溫的適應策略

食物質量對昆蟲的越冬至關重要。Hunter和McNeil等研究表明寄主植物對多食性昆蟲幼蟲的生長發育、滯育誘導、抗寒能力有重要影響[7];Liu等研究了食物質量對棉鈴蟲越冬的影響,發現寄主植物營養越豐富,棉鈴蟲蛹越重,積累的總類脂和糖原也越多,且蛹的過冷卻點與這些物質含量有很強的相關性[8]。

不同昆蟲的抗寒性差異很大。一般情況下,處在高緯度、高海拔地區的昆蟲比低緯度、低海拔地區的昆蟲有更強的抗寒能力。極地昆蟲的多樣性也證明了他們具有很強的抗寒能力。處于不同地理緯度的同一種昆蟲,其抗寒能力也不相同。一般來講,昆蟲所在地區緯度越高,其抗寒性越強。低緯度和熱帶地區的昆蟲,其抗寒性偏低,如不同地理起源的白紋伊蚊[Aedesalbopictus(Skuse)]卵的抗寒性就顯著不同[3]。

個體的不同發育階段,其抗寒性也存在差異。通常是越冬蟲態的抗寒性最強,休眠或滯育期對低溫的耐受能力較強,生長發育期的蟲態抗寒性較弱。例如,舞毒蛾[Lymantria dispar(Linnaeus)]的成蟲在-4℃時只能存活30 min,而卵在-20℃都不會死亡;甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]不同蟲態抗寒性由弱至強分別是：卵、成蟲、幼蟲和蛹[4]。

低溫對昆蟲的生長發育是不利的,但是昆蟲在長期的進化中形成了一系列的適應性對策。這些對策大致可以分為兩類：一是行為對策或稱為生態型對策,即通過某些行為活動尋找躲避場所。如生活在土壤中的黃地老虎[Agrotis segetum(Denis et Schiffermüller)],隨著冬季地溫的降低,它會潛入到土壤深處以躲避低溫傷害;二是生理對策,即通過改變生理狀態提高抗寒性。

低溫馴化對昆蟲抗寒性有著重要的影響[5]。在自然條件下,昆蟲越冬前都要經歷一個體溫漸變的過程,為度過低溫環境做些生理準備,這是昆蟲種群受到自然界低溫馴化的緣故。快速冷馴化(rapid cold-hardening)則是經歷短時間的低溫馴化,如5、20 min等。對很多昆蟲來說,這一過程可以使它們免于遭受過冷卻點(super-cooling point,SCP)以上的低溫帶來的傷害,如蠅類的非滯育蟲態,在0℃馴化10～60 min后遭受-10℃的低溫脅迫,其存活率可從20%提高到80%[6]。

3 昆蟲的抗寒性機制

3.1 昆蟲抗寒性的生理生化機制

根據昆蟲抗寒性的生理生化機制,可以分為耐寒昆蟲(freeze-susceptibles)和耐凍昆蟲(freeze-tolerants)[9]。

3.1.1 耐寒性昆蟲的抗寒機制

耐寒昆蟲一般通過降低過冷卻點,減少體內含水量,排除體內冰核物質和積累抗寒物質等方式來抵抗凍害。

3.1.1.1 降低過冷卻點

過冷卻點是昆蟲抗寒性的一個重要指標[10]。在溫帶、寒帶地區,冬季溫度通常低于冰點(freezing point,FP),昆蟲可以通過體液過冷卻的方式,避免結冰造成傷害。飛蝗卵的過冷卻點約為-26℃,幼蟲通常為-30℃左右,個別種可以達-60℃。鱗翅目昆蟲蛹的平均過冷卻點(mean super-cooling point,MSCP)很少低于-30℃,成蟲的過冷卻能力差異較大,具有選擇棲境習性的成蟲,MSCP常為-10～-20℃[11]。較強的過冷卻能力能使蟲體在低溫下處于過冷卻狀態而不結冰,從而獲得耐寒性。

3.1.1.2 降低體內含水量

耐寒性昆蟲在適應寒冷的過程中,體內含水量大大下降,許多昆蟲在越冬時體內含水量幾乎下降到致死臨界點。水分的排除增加了體內溶質的濃度,降低了體液的冰點和過冷卻點。此外,由于含水量的降低,體內連續較大的整體水相可以被一些組織或某些高濃度的物質所分離,從而有利于昆蟲體液的過冷卻。孫緒艮等研究發現桑尺蠖(Phthonandriaatrilineata Butler)幼蟲在越冬過程中體內水分含量呈下降趨勢[12]。

3.1.1.3 排除體內冰核物質

昆蟲體內的冰核可以在體液中或細胞質基質中,也可以是腸道中的食物顆粒及冰核細菌。這些物質在低溫時可誘發結冰,導致消化道膨脹破裂而死亡。昆蟲是一個含水系統,過冷卻點與體內冰核的數量和活性有關。為了避免結冰,昆蟲在越冬前把冰核排出體外或使之失去活性,以降低過冷卻點,減少越冬死亡率[13]。低溫學研究表明：水分保持過冷卻的能力與其中存在的冰核有關,當只有同源冰核(homogeneous ice nuclei)存在時,過冷卻可以保持-39℃,但是當存在異源冰核(heterogeneous ice nuclei)時,冰核的活性越高,保持過冷卻的能力就越低,也就越容易在接近0℃以下時結冰。一些越冬昆蟲之所以能夠在很低的溫度下保持過冷卻狀態,與其體內缺乏異源冰核有關。生物冰核是自然界冰核活性最高的物質,能在-1.5℃誘發結冰。其中冰核細菌能在昆蟲體上起到異源冰核的作用,從而提高蟲體的結冰溫度。

3.1.1.4 積累抗寒物質

昆蟲抗寒性物質包括兩類,即小分子的物質和抗凍蛋白(antifreeze proteins,AFPs)。目前已知的小分子抗寒性物質有甘油、山梨醇、甘露醇、五碳多元醇(可能是阿拉伯糖醇或核酸醇)、海藻糖、葡萄糖、果糖以及某些昆蟲體內的氨基酸和脂肪酸。Duman對黃粉甲(Tenebrio molitor Linnaeus)等13種昆蟲的研究表明,糖蛋白的增加與抗寒力的增強有著十分密切的關系,因而糖蛋白又稱為溫滯蛋白,溫滯蛋白通過吸附到冰核和冰晶表面來阻止水的晶化,從而降低冰點和過冷卻點,產生溫滯效應[14]。不同昆蟲積累的物質種類和含量是不同的,但大多數昆蟲都由幾種抗寒物質構成一個物質系統。例如Holden報道了歐樺小蠹蟲(Scolytus ratzeburgi Janson)幼蟲的甘油-山梨醇-葡萄糖-海藻糖系統[15];黃國洋報道了黃地老虎幼蟲的小分子糖-氨基酸-糖蛋白系統[16];陳永杰研究證實,桑絹野螟(Diaphania pyloalis Walker)越冬幼蟲以“小分子碳水化合物(海藻糖、甘露醇、山梨醇)-氨基酸[絲氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)]-甘油-蛋白質-結合脂肪”組成抗寒物質系統[17];梁中貴研究認為松阿扁葉峰(Acantholyda posticalis Matsumura)越冬幼蟲血淋巴內丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、胱氨酸(Cys)、精氨酸(Arg)等氨基酸的含量在越冬過程中均明顯高于越冬前和越冬后,是重要的抗寒物質[18];韓瑞東等研究了赤松毛蟲(Dendrolimus spectabilis Butler)越冬幼蟲生化物質變化與抗寒性的關系,認為其幼蟲越冬的抗寒物質系統為小分子碳水化合物類(山梨醇、海藻糖、葡萄糖)-糖蛋白-氨基酸類(丙氨酸(Ala)、蘇氨酸(Thr)、谷氨酸(Glu)等)[19]。

低溫下昆蟲體內產生的抗凍蛋白能夠長時間地維持亞穩定的過冷卻狀態,這是不耐結冰昆蟲的重要抗寒機制。抗凍蛋白是一類能控制冰晶生長和抑制冰晶之間發生重結晶的蛋白質,能以非依數形式降低水溶液的冰點,但對熔點影響甚微,從而導致水溶液的熔點和冰點之間出現差值,這種差值稱為熱滯活性或抗凍活性,差值越大抗凍活性也越大[20]。昆蟲的體液以及腸液和細胞內液中都有抗凍蛋白的產生,其中對鞘翅目抗凍蛋白的研究比較深入。

3.1.2 耐凍性昆蟲的抗寒機制

耐凍性昆蟲在低溫到來時,并不阻止體內結冰,卻能忍受體液結冰。絕大多數耐凍性昆蟲血淋巴中有高效的晶核物質,它不受小分子抗寒物質和抗凍蛋白的影響,溫度稍低就能有效地激發體液結冰。關于這類昆蟲的耐凍機制,普遍認為是因其在較高的零下低溫細胞外血淋巴結冰,從而使細胞內其他重要部位免于結冰。此外,在耐凍性昆蟲體內也有一些小分子抗凍劑的積累,如甘油、赤鮮糖醇、蘇糖醇和基糖等。這些物質含有的羥基能有效地與水結合,減少水的流動性,從而有效地防止結冰對昆蟲造成的損害。水流動性的減少可以穩定蛋白質結構,維持膜的流動性,減少快速結冰造成的損傷,協同血淋巴高效晶核,維持昆蟲的耐凍性[21-22]。

昆蟲的耐凍性適應比耐寒性適應具有明顯的優越性,由于血淋巴中的晶核物質活性較消化道和細胞內的大,這對低溫休眠、冬季取食和一些內陸高山氣候下生活的昆蟲極為有利,使它們可以在白晝溫度較高時取食,而夜晚低溫結冰也不會因消化道內攝入晶核而死亡。

3.2 昆蟲抗寒性的分子機制

近年來人們越來越多的關注昆蟲抗寒性的分子機制,包括對抗凍蛋白和熱激蛋白(heat shock proteins,HSPs,以下統稱熱激蛋白)的基因、結構、功能的研究等。

隨著研究的日益深入,昆蟲抗凍蛋白的研究范圍越來越廣,在昆蟲中已經報道了20多種抗凍蛋白,研究對象已涉及彈尾目、襀翅目、直翅目、半翅目、長翅目和鞘翅目等一些昆蟲[23-25]。昆蟲抗凍蛋白的分子量大都在7～20ku之間,無糖基,含有比魚類更多的親水性氨基酸,而且昆蟲抗凍蛋白的活性普遍高于魚類抗凍蛋白的活性,這可能與冬季陸地的溫度更低有關[26]。但是,云杉色卷蛾[Choristoneura f umi ferana(Clemens)]抗凍蛋白與魚類Ⅱ型抗凍蛋白有免疫交叉反應[27-28],說明這些魚類和昆蟲的抗凍蛋白有共同的抗原決定簇。

黃粉甲的抗凍蛋白,含有呈β-螺旋結構的串聯重復序列(C1T2X3X4X5X6C7X8X9X10X11X12),12個氨基酸的環與主鏈保持一致,且保守序列編碼的氨基酸在空間結構的位置也保持一致,所有的半胱氨酸(Cys)都高度保守,都以每6個氨基酸殘基有1個半胱氨酸的模式始終貫穿于抗凍蛋白的整個氨基酸鏈中[29-30],被認為是目前所發現的最為有序的蛋白結構。赤翅甲蟲(Dendroides canadensis)抗凍蛋白H1組分含有較多的半胱氨酸(15.9%),幾乎有1/2的半胱氨酸殘基涉及二硫鍵的生成,二硫鍵在維持抗凍蛋白高度有序的結構中起到了極其重要的作用[31]。云杉色卷蛾幼蟲的抗凍蛋白,富含蘇氨酸、L-胱氨酸(L-Cys)、絲氨酸,其總體結構是左手β螺旋,占70%～80%,由6個環構成,氨基端是非完全的環狀結構,連接4個由15個氨基酸組成的左手環,羧基端是17個氨基酸構成的右手環,環之間通過二硫鍵或β折疊連接。這種抗凍蛋白具有Thr-X-Thr模體,其排列與冰的網絡結構相吻合,它由14個蘇氨酸組成,其中9個與冰相結合,此種結構與抗凍蛋白功能的發揮密切相關[32]。

最近國內也克隆分析了一些具有低溫保護作用的抗凍蛋白基因,如楊長庚構建了擬步行蟲科光滑鱉甲(Anatolica polita Borealis)的 cDNA文庫,并篩選擴增出321 bp的抗凍蛋白基因,該基因可能與抗凍蛋白結合于冰晶生長位點有關[33]。趙干等利用RT-PCR和RACE技術獲得準噶爾小胸鱉甲(Microdera punctipennis Dzhungarica)抗凍蛋白基因家族序列19個,光滑鱉甲抗凍蛋白基因家族序列12個以及卵形刺甲[Platyscelis(Pleiopleura)ovata Ballion]抗凍蛋白基因家族序列5個[34]。呂國棟用原核表達系統表達了擬步行蟲科喀什琵琶甲(Blapskashgarensis Bates)抗凍蛋白(BkAFP972),細菌低溫保護試驗表明,喀什琵琶甲抗凍蛋白能夠提高細菌在低溫環境中的存活率,具有低溫保護作用[35]。

熱休克蛋白(HSPs)是指生物體細胞在高溫(熱激)或其他應激原作用下所誘導生成或合成的一組蛋白質。Denlinger等認為熱激蛋白在昆蟲越冬過程中扮演著重要的角色[36-37]。很多研究表明熱激蛋白的表達量與昆蟲的滯育密切相關[38-40],最近的研究又發現熱激蛋白與昆蟲對低溫的耐受性密切相關[41-44],Huang等研究了低溫誘導熱激蛋白與美洲斑潛蠅(Liriomyza sativae Blanchard)生長發育的關系,結果表明 hsp 19.5、hsp20.8、hsp21.7三個基因能被低溫誘導表達;hsp19.5、hsp20.8 、hsp21.7、hsp60 、hsp90 五個基因的相對表達量在不同生長發育階段差異顯著,hsp19.5、hsp20.8、hsp21.7在蛹期表達量最高,而hsp60和hsp90的表達量隨著生長發育而遞增,成蟲期最高[45]。這些研究結果進一步增加了人們對熱激蛋白基因功能的了解,并為研究昆蟲的生長發育和變態提供了新的思路。

3.3 昆蟲的滯育與抗寒

滯育(diapause)是由神經激素調節的、呼吸代謝速率緩慢的一種動態過程,是昆蟲為躲避不利環境條件而中止發育的一種適應,也是昆蟲生活周期與季節變化保持一致的一種基本手段。滯育昆蟲在生理上的表現是：生長發育停頓,呼吸率降低,蟲體含水量下降,脂肪含量增加,某些酶系活性降低,抗寒性和抗藥性增加[46-47]。

昆蟲在滯育期間,體內會積累很多物質,如脂肪、糖類等,這與其越冬期間的耐寒能力密切相關。張珺等比較了北京和福州2個地理種群二化螟(Chilo suppressalis Walker)滯育誘導、低溫存活、過冷卻點和滯育幼蟲抗寒性生理指標的差異。研究發現,隨著地理緯度的上升,二化螟種群的耐寒性增強,滯育與非滯育幼蟲的體重差異顯著,滯育幼蟲體內的含水量低于非滯育幼蟲,蛋白質和糖含量高于非滯育幼蟲[48]。

昆蟲為躲避不利環境開始滯育,而當環境轉變為適宜的生長條件時,又開始恢復生長發育,同時使得兩性個體發育齊一,利于生殖交配同步化,因此關于滯育機理的相關研究也引起了大家的關注。Gkouvitsas等表達了影響西非蛀莖夜蛾(Sesamia nonagrioides Lefevre)滯育的2個小片段基因hsp19.5和hsp20.8,發現這2個基因在滯育過程中扮演著不同的角色,hsp20.8在滯育期間表達量下降,滯育解除后表達量上升,而hsp19.5在滯育前后都是持續表達的[49]。

隨著蛋白質組學的發展,其相關技術也被用于研究與昆蟲滯育相關的蛋白[50]。Li等比較了滯育和非滯育家蠅(Musca domestica Linnaeus)蛹的腦部蛋白組差異,發現熱激蛋白在滯育蛹中高量表達,而磷酸烯醇式丙酮酸合成酶、脂肪酸結合蛋白、核酸內切酶等表達量下降[51]。Li等又比較了滯育解除后24 h的家蠅蛹的腦部蛋白組變化,發現有20個蛋白表達量發生了變化,其中11個蛋白的表達量上升了2.5倍,其中有3個蛋白只存在滯育蛹中,滯育解除后脂肪結合蛋白、CG2331-PA 、過氧化氫酶、組蛋白等表達量下降,而且核糖體蛋白 L17A和一個未知蛋白缺失,Western雜交結果表明誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)蛋白的表達量上升[52]。

4 昆蟲抗寒與害蟲預測預報及防治的關系

昆蟲能否成功越冬直接影響其來年的發生量,研究昆蟲的抗寒性不僅對于明確其生態機制及進化具有重要意義,而且對于準確進行害蟲發生的預測預報和害蟲的綜合治理研究非常重要。

對于一些世界性的重要害蟲,很多昆蟲學家都開展了一系列相關研究。吳孔明等研究了我國不同地理種群棉鈴蟲的抗寒性,并首次提出我國棉鈴蟲越冬的北界是在1月份-15℃等溫線,長江流域的棉鈴蟲在華北地區難以越冬,華北棉區棉鈴蟲以滯育蛹越冬,東北棉區一代棉鈴蟲是由華北地區遷入。這些研究明顯提高了我國棉鈴蟲預報的準確性,為建立我國的棉鈴蟲區域性災變預警技術體系奠定了基礎[53]。

美國白蛾[Hyphantria cunea(Drury)]屬鱗翅目燈蛾科,是一種多食性的檢疫性害蟲,在世界各地都造成了嚴重危害[54]。鞠珍較系統地研究了美國白蛾不同時期蛹的抗寒能力變化,結果表明,雌、雄蛹的抗寒能力均呈現出不同的變化趨勢：隨著冬季低溫的到來,其抗寒能力逐漸增強,冬季過后隨氣溫的回升,其抗寒力逐漸減弱;雌、雄蛹的過冷卻點和冰點均隨氣溫的變化而變化;體內含水量隨時間的推移而升高;體內總脂肪的含量卻隨氣溫的降低而升高。美國白蛾蛹的抗寒能力變化的研究,為其發生和預測預報提供了理論依據,對美國白蛾的有效防治具有重要的指導意義和實踐價值[55]。

冰核細菌對赤松毛蟲幼蟲的抗寒能力的影響十分明顯。韓瑞東等分析了赤松毛蟲越冬行為與溫度和抗寒能力的關系,并用冰核細菌接種,明確了該菌對幼蟲過冷卻點和致死中時的影響。結果表明,冰核細菌可以作為一種低溫增效劑,促使赤松毛蟲幼蟲在高于過冷卻點的溫度下結冰致死,可以作為一種促凍殺蟲劑,利用冬季低溫和春季偶然的寒流來防治赤松毛蟲[56]。

陳永杰等研究認為冬季寒流對桑螟越冬幼蟲的死亡率影響很大,寒流盛行的年份能顯著降低來年的蟲源基數[3]。我國也針對很多害蟲的越冬習性,提出了冬耕冬灌降低早春蟲源的綜合防治措施,冬耕冬灌的地塊棉鈴蟲蛹的越冬死亡率可達80%～90%,比不進行耕灌的增加1倍左右[57]。隨著人們對昆蟲抗寒性研究的進一步深入,不僅可以更全面的理解其抗寒機制,而且昆蟲抗寒性的生態學意義會得到進一步的應用。

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