白術(shù)和黃芪種子試管內(nèi)萌發(fā)試驗研究

洪森榮，尹明華，葉利民，李 玲

（上饒師范學院生命科學學院，江西 上饒 334001）

白術(shù)（AtractylodesmacrocephalaKoidz.）系菊科植物，其干燥根莖具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之效，主治脾虛食少、腹脹、水腫、胎動不安等癥[1]。栽培中常用種子或塊根繁殖，但都難以在短期內(nèi)大面積種植[2]，黃芪（Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.）屬于豆科黃芪屬的多年生草本植物[3]。黃芪具有增強機體免疫力功能、強心降壓、降血糖、利尿、抗病毒等作用，國內(nèi)外市場對其需要量越來越大[4]。目前對于黃芪的研究主要集中于其多糖、黃酮等有效成分的提取及其應(yīng)用價值的研究，對黃芪組織培養(yǎng)的研究報道較少[4-7]。初步研究了白術(shù)和黃芪種子的試管內(nèi)萌發(fā)，以期為白術(shù)和黃芪無菌體系建立、快速繁殖以及白術(shù)和黃芪的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白術(shù)種子和黃芪種子購于浙江省景寧縣梧桐鄉(xiāng)藥材專業(yè)合作社，原產(chǎn)地為安徽亳州。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同消毒方式對白術(shù)種子萌發(fā)的影響 配置1/2 MS培養(yǎng)基（大量元素減半，其他基本成分不變），加入30 g/L蔗糖和7.5 g/L瓊脂，pH值調(diào)為5.8～6.0。用聚乙烯封口膜封好，貼上標簽。放入高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌（溫度：120℃，時間：20min）。滅菌冷卻后備用。挑選成熟飽滿的白術(shù)種子，分成3組，放入超凈工作臺內(nèi)依次進行消毒，消毒方式設(shè)置如下：（1）用75%酒精消毒30 s，無菌水浸洗1次；再用0.1%HgCl2消毒1min，無菌水浸洗1次。（2）用75%酒精消毒30 s，無菌水浸洗1次；再用0.1%HgCl2消毒5 min，無菌水浸洗1次。（3）用75%酒精消毒30 s，無菌水浸洗1次；再用0.1%HgCl2消毒10 min，無菌水浸洗1次。材料消毒以后，接種在1/2 MS培養(yǎng)基上，放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光照時間12 h/d，光照強度1 200~1 400 lx，溫度（25±1）℃，濕度60%～80%。每天觀察種子萌發(fā)情況并記錄種子萌芽、生根、出苗的時間以及種子污染情況，45 d時統(tǒng)計白術(shù)種子的萌發(fā)率、污染率。萌發(fā)率=（出芽的種子粒數(shù)/總接種數(shù)）×100%，污染率=（污染粒數(shù)/總接種粒數(shù)）×100%。

1.2.2 培養(yǎng)基無機鹽水平對白術(shù)種子萌發(fā)的影響挑選成熟飽滿的白術(shù)種子，放入超凈工作臺內(nèi)進行消毒，種子消毒方法用75%酒精消毒30 s，無菌水浸洗1次；再用0.1%HgCl2消毒5 min，無菌水浸洗1次。材料消毒以后接種在不同無機鹽水平的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基設(shè)置如下：（1）MS；（2）1/2MS；（3）1/4 MS。培養(yǎng)基中加入蔗糖30 g/L、瓊脂7.5 g/L，pH調(diào)節(jié)為5.8～6.0，用封口膜封口，高壓滅菌鍋中滅菌。每個瓶中接入5～6粒種子不等。接種后放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察種子萌發(fā)、生根情況，45 d時統(tǒng)計萌發(fā)率。

1.2.3 不同消毒方式和培養(yǎng)基類型對黃芪種子試管內(nèi)萌發(fā)的影響 配置固體和半固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂7.5 g/L，半固體培養(yǎng)基加入瓊脂3.5 g/L。封口膜封口并滅菌。挑選飽滿黃芪種子放入工作臺內(nèi)消毒，消毒方式設(shè)置如下：（1）用75%酒精消毒20 s，無菌水浸洗1次；再用0.1%HgCl2消毒5～8min，無菌水浸洗1次。種子消毒后接入固體和半固體培養(yǎng)基中；（2）用75%酒精消毒20 s，無菌水浸洗1次；再用0.1%HgCl2消毒10～15 min，無菌水浸洗1次。種子消毒后接入固體和半固體培養(yǎng)基中。每支試管接入3～10粒黃芪種子不等，接種后放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察黃芪種子發(fā)芽情況。15 d時統(tǒng)計其萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗為單因子試驗，數(shù)據(jù)均取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒方式對白術(shù)種子萌發(fā)的影響

種子接入培養(yǎng)基4 d后，就出現(xiàn)種子污染情況，用75%酒精消毒30 s再用0.1%HgCl2消毒1 min的種子最先出現(xiàn)污染，長出白色絨毛狀菌體，圓形菌落，菌落隨時間不斷擴大，最后布滿整瓶，菌體由白色變?yōu)槟G色，最后變成黑色。接入的種子有輕微的褪色，種子在逐漸脹大，但30 d后，無一粒種子萌發(fā)，45 d時開始有種子發(fā)芽并生根。由表1可知用0.1%HgCl2消毒時間越短，白術(shù)污染率越高，但種子消毒時間過長或過短對白術(shù)種子的萌發(fā)都不利。因此，白術(shù)種子最佳的消毒方式是：75%酒精消毒30 s再用0.1%HgCl2消毒5min。

2.2 無機鹽水平對白術(shù)種子萌發(fā)的影響

表1 消毒方式對白術(shù)種子萌發(fā)和污染的影響（45 d）

白術(shù)種子接到不同無機鹽水平培養(yǎng)基上，有輕微的褪色，種子也有一定脹大，但一直沒有萌發(fā)跡象，到45 d時開始出現(xiàn)種子萌發(fā)。無機鹽濃度過低對白術(shù)種子萌發(fā)不利。無機鹽水平為1/4MS時，種子萌發(fā)率為0；無機鹽水平為MS和1/2 MS時，白術(shù)種子萌發(fā)率相對較高，分別為3.5%和3.7%，總體上白術(shù)種子在試管內(nèi)的萌發(fā)率較低。

2.3 消毒方式和培養(yǎng)基類型對黃芪種子試管內(nèi)萌發(fā)的影響

黃芪種子培養(yǎng)2 d后，用0.1%HgCl2消毒5 min的種子接到半固體培養(yǎng)基上的最先有種子發(fā)芽，4 d后，其他種子也有發(fā)芽，萌發(fā)情況統(tǒng)計如表2所示，從表2中可知，半固體培養(yǎng)基中種子萌發(fā)率高于固體培養(yǎng)基，用0.1%HgCl2消毒10～15min對黃芪種子適合。

表2 消毒方式和培養(yǎng)基類型對黃芪種子試管內(nèi)萌發(fā)的影響（15 d）

3 討論

本試驗對于白術(shù)萌發(fā)的初步研究表明，用0.1%HgCl2對白術(shù)消毒5min的消毒效果最好，污染率較低。但1/2 MS培養(yǎng)基上的種子萌發(fā)率僅為3.7%。因此，在本試驗中，白術(shù)種子總的萌發(fā)率較低，究其原因可能有以下幾點：首先是因為白術(shù)種子外表皮有一層茸毛，如果消毒液沒有完全浸透種子，茸毛中的細菌無法殺死，種子易污染，從而影響種子萌發(fā)。其次是因為種子體型較大，種子萌發(fā)需要吸收一定量的水分通過吸脹階段才能萌發(fā)，本試驗采用固體培養(yǎng)基水分不足，導致實驗后期培養(yǎng)基干裂，種子無法吸水導致萌發(fā)率低。另外可能是因為本試驗所購買的白術(shù)種子本身活力低，萌發(fā)率不高。但李慧[2]把白術(shù)種子在流水中沖4～6 h，剝?nèi)シN皮，用0.2%HgCl2浸泡20 min后白術(shù)種子萌發(fā)率很高。本試驗也表明，培養(yǎng)基中添加瓊脂量的多少對黃芪種子的萌發(fā)有影響，加入瓊脂量少的半固體培養(yǎng)基，黃芪種子萌發(fā)率高，而添加瓊脂量多的固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基易硬化，影響了養(yǎng)分和水分的吸收，導致黃芪種子萌發(fā)率低。因此，采取半固體培養(yǎng)基對于黃芪種子萌發(fā)有利。本試驗結(jié)果可以為白術(shù)和黃芪試管苗無菌體系的建立提供理論依據(jù)。

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