免疫酶吸附法評價納米金對抗體Fc端的吸附效果

湯俊琪, 龐廣昌, 高嘉榮, 梁新義

(天津市食品生物技術重點實驗室,天津商業大學,天津300134)

近年來,納米粒子以其獨特的物理、化學、光學性能被廣泛的用于生物測定分析中[1-4]。納米金溶膠又叫膠體金,因其具有很高的比表面效應和較強的吸附能力,可與生物活性物質結合作為追蹤標記探針,早在1971年Faulk等就利用金溶膠顆粒作為標記物用于免疫電鏡技術[5-6]。對于膠體金和抗體等生物物質的結合,人們普遍認為是膠體金表面負電荷和抗體等高分子的正電荷基團因靜電作用而吸附,并形成Au-S等穩定化學鍵而形成了牢固結合[7-9]?？贵w等生物分子具有特定的功能區,如抗體Fc端不能識別其對應抗原,只有其 Fab端才具有識別抗原并與其相結合的能力,這樣才可發揮抗體的特定作用[10]。為最大限度的保留抗體的生物活性,對抗體的固定吸附等修飾只能在Fc端進行。所以明確納米金和抗體 Fc端的吸附情況至關重要,對于這方面的研究,目前尚未見報道。

作者利用常見的酶免疫吸附法,研究了以微波制作的納米金和抗體的吸附情況。納米金不僅能與抗體結合,而且可通過離心形成沉淀。因此,在納米金吸附IgG的溶液中加入酶標羊抗兔 IgG的二抗,然后離心,可將納米粒子/兔IgG/酶標羊抗兔IgG復合物從溶液中分離。則清液中的物質為未和兔IgG結合并保留下來的酶標抗體,加入底物顯色液,就可正常顯色。如果同時以同濃度的兔IgG溶液和酶標羊抗兔 IgG反應,加入底物顯色液,顯色后測定其OD值,通過兩次OD值得對比,可得到納米金對兔IgG即納米金對抗體 Fc端的吸附率,實驗過程見圖1。

圖1 簡明實驗過程圖Fig.1 Schematic illustration of the stepwise experiment process

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-2501紫外可見分光光度計:日本島津公司產品;高速冷凍離心機:SIGMA公司產品;超聲洗滌儀:昆山市超聲儀器有限公司產品;電熱恒溫水浴器:上海一恒科學儀器有限公司產品;酶標儀:Thermo公司產品。

兔IgG(10 mg/mL);HRP-羊抗兔抗體(1:500～1000);牛血清白蛋白:BSA;氯金酸:天津科密歐公司產品;硼酸鹽緩沖液(p H=9.0);質量分數10%的NaCl溶液;0.1 mol/L的 K2CO3;2 mol/L的H2SO4;0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液(p H=7.4);鄰苯二胺(OPD)溶液(10 mg OPD溶于 50 mL p H=5.0底物緩沖液中,再加雙蒸水至100 mL);所有試劑都為分析純,購買后未進行再純化處理,整個過程都使用雙蒸水。

1.2 實驗過程

1.2.1 納米金溶膠的制備 納米金溶膠由質量分數0.01%的HAuCl4溶液和檸檬酸三鈉溶液在微波爐中還原獲得[11]。錐形瓶在酸缸浸泡過夜(濃硫酸、重鉻酸鉀混合液)、超聲洗滌后,再用雙蒸水洗滌3次。稱取0.01g氯化金溶于100 mL的雙蒸水中得到質量分數0.01%的氯金酸溶液。該溶液在微波爐中先高檔沸騰2 min。迅速加入4 mL的質量分數1%檸檬酸三鈉水溶液,再放入微波爐中中擋保持3 min,就可得到透明的橙紅色溶液,即為15 nm左右的膠體金。改變檸檬酸三鈉的用量可得到不同粒徑的膠體金。制備好的金膠溶液在4℃避光保存備用。

1.2.2 納米金對兔IgG的吸附 取5 mL納米金溶液,用0.1 mol/L的 K2CO3溶液調節納米金液的p H值。由于在p H=9.0時,納米金和IgG結合最牢固最穩定。加入20μL 10 mg/mL的兔 IgG,溫和混合2 h。再加入100μL質量分數1%的BSA溶液反應30 min,在4℃下15 000 r/min離心20 min。小心移取上清液,紫紅色沉淀用1 mL 1%的BSA溶液溶解,搖勻后4℃下保存備用。

1.2.3 免疫反應和吸附效果的測定 取100μL的納米金-兔IgG混合溶液,加入1 mL酶標羊抗兔溶液(p H=7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋),37℃水浴反應60 min。4 ℃左右15 000 r/min離心20 min,取上清液100μL加入100μL鄰苯二胺(OPD)底物溶液避光反應10 min,加入50μL 2 mol/L的硫酸溶液中止反應,在酶標儀中492 nm波長下測定O.D值。

對照實驗中,將納米金表面的活性位點以BSA溶液完全封閉,然后加入兔 IgG溶液,從而獲得納米金-BSA,兔IgG混合溶液。同樣取100μL該混合溶液,加入酶標抗體后以鄰苯二胺顯色,步驟同上?；蛘咧苯右酝?IgG溶液加入酶標抗體后以鄰苯二胺顯色進行測定,實驗條件也完全同上。

2 結果與討論

2.1 納米金溶液的表征

采用UV-2501紫外可見分光光度計測定雙蒸水稀釋2倍的納米金溶液,在400～700 nm波長范圍內掃描,表征納米金溶液的特征吸收峰。圖1是該金膠溶液的吸收曲線,由圖可見,在519 nm左右有很強的吸收峰。光吸收性膠體金在可見光范圍內有一單一光吸收峰,這個光吸收峰的波長(λmax)在510～550 nm范圍內,隨膠體金顆粒大小而變化。從而可知本研究制備的膠體金顆粒粒徑在15 nm左右[12]。

圖2 納米金溶液的掃描圖Fig.2 Spectral absorption curve of gold colloidal solution

2.2 納米金和兔IgG的最適反應比例

納米金標記 IgG的最佳p H值一般在9.0左右。將調好p H的膠體金,分裝8管(見圖3),每管1 mL。將IgG以0.005 mol/L p H=9.0硼酸鹽緩沖液稀釋為5～50μg/mL系列,分別取1 mL,加入到上述金膠溶液中(2～7號管),混勻?？瞻讓φ展?左1號管)只加1 mL緩沖液,空白對照管(右1號管)則加1 mL雙蒸水。5 min后,在上述各管中加入0.1 mL質量分數10%NaCl溶液,混勻后靜置2 h,觀察結果?？梢钥闯?0～50μg/mL的抗體溶液能穩定膠體金溶液,說明此質量濃度下抗體膠體金比例合適。

圖3 納米金對不同濃度兔IgG的吸附Fig.3 Gold colloidal absorb rabbit IgG with different concentration

2.3 納米金吸附兔IgG的表征

分別取2 mL金標抗體和納米金溶液,稀釋2倍后在分光光度計下以400～620 nm波長掃描,對比二者的掃描曲線(圖4),可以看出納米金溶液在518 nm處有最大的光吸收峰,而金標抗體溶液的最大光吸收峰在526 nm,相同的稀釋倍數下,不僅金標抗體的吸收峰值明顯降低,而且出現明顯的紅移現象。這表明抗體很好的吸附在納米金表面。

圖4 相同稀釋倍數的納米金和納米金-抗體溶液的光譜掃描圖Fig.4 Spectral absorption curve of gold colloidal solution and nano-gold labeledantibody solution with the same dilution times:a—Nano-Au,b—Nano-Au-IgG

如將納米金溶液稀釋4倍,則可更加明顯的看到納米金吸附抗體前后,納米金溶液的最大光吸收峰的紅移現象(圖4)。

圖5 納米金和納米金-抗體的光譜掃描圖Fig.5 Spectral absorption curve of gold colloidal solution and nano-gold labeledantibody solution with the different dilution times:a—Nano-Au,b—Nano-Au-IgG

2.4 納米金吸附兔IgG Fc端的效果測定

分別用 500、1 000、2 000、4 000、8 000、16 000倍的酶標抗體稀溶液來測定膠體金對抗體的吸附效果,所測都是上清液的OD值。3種情形在不同稀釋倍數下的OD值如下表(表1)。

表1 不同稀釋倍數下的OD值Tab.1 OD of different dilution multiple HRP-labeled rabbit IgG

以OD值為縱坐標,酶標抗體的不同稀釋倍數為橫坐標,結果見圖圖6。

圖6 不同稀釋倍數下對應的OD值Fig.6 OD of different dilution multiple HRP-labeled rabbit IgG

獲得納米金對抗體的吸附效果,分別以納米金-BSA,兔IgG混合溶液和兔 IgG溶液作為對照進行測定。研究中假定酶標抗體對暴露的兔IgG的Fc端具有完全的吸附能力,在不同的實驗條件下,納米金對兔IgG的 Fc端的吸附能力,就可通過對比而獲得。當兔IgG加入到納米金溶液中后,則認為納米金要么吸附在其Fc端,要么吸附在其Fab端。兔IgG的Fc端被納米金吸附后,就不能再和酶標羊抗兔相結合,凡是 Fc端沒有被納米金結合的兔IgG則可以和酶標羊抗兔抗體結合,發生這種結合后,經過離心,必然導致酶標抗體的量的減少。留在上清液中的酶標抗體,通過加入酶的底物顯色可獲得其對應的O.D值。如果兔 IgG的 Fc端完全被納米金結合,則經過離心后酶標抗體的量不會減少,那么可以用兔IgG作為對照,假定這種情況下,酶標羊抗兔和兔 IgG的 Fc端結合率為100%。則可以推算出納米金和抗體吸附效果。兔IgG和酶標羊抗兔反應后,經離心顯色后可以發現納米金確實對顯色存在一定的影響。為避免納米金對實驗中顯色的影響,故以納米金-BSA,兔 IgG作為對照來推算這種效果(見表2)。

表2 納米金對抗體Fc端的吸附率Tab.2 Absorption effect of nano-gold to antibody Fc

3 結 語

作者應用微波爐產生的微波來制作納米金溶膠,方法簡單而快速,并用簡單的光譜法證明了獲得的納米金的光吸收特征,且證明了該納米金粒子對抗體Fc端的吸附效果,說明納米金對抗體的吸附效果比較優良,尤其對抗體 Fc端的吸附率非常的高,達到92%以上。該過程方法簡單,利用了離心分離和酶標抗體的顯色能力,通過免疫酶吸附技術進行測定,獲得了較理想的結果,盡管可能存在一定的誤差,但為以后應用納米金對抗體進行修飾或固定,尤其是免疫傳感器中定向固定抗體等具有一定的參考價值。

[1]LIU G D,LIN Y H.Nanomaterial labels in electrochemical immunosensors and immunoassays[J].Talanta,2007,74(3):308-317.

[3]ZHANG S B,WU Z S,GUO M M,et al.A novel immunoassay strategy based on combination of chitosan and a gold nanoparticle label[J].Talanta,2007,71(4):1530-1535.

[4]Olkhov R V,Shaw A M.Label-free antibody antigen binding detection by optical sensor array based on surface-synthesized gold nanoparticles[J].Biosensors and Bioelectronics,2008,23(8):1298-1302.

[5]Faulk W P,Taylor G M.An immunocolloid method for the electron microscope[J].Immunochemistry,1971,8:1081-1083.

[6]孫秀蘭,趙曉聯,湯堅.納米金溶膠形成過程的可見光吸收光譜研究[J].無錫輕工大學學報(食品與生物技術學報),2004,23(4):86-89.SUN Xiu-lan,ZHAO Xiao-lian,TANG Jian.The UV-visible spectrum,studies on formation process of colloidal gold particles[J].Journal of Wuxi University of Light Industry,2004,23(4):86-89.(in Chinese)

[7]LIANG R P,QIU J D,CAI P X.A novel amperometric immunosensor based on three-dimensional sol gel network and nanoparticle self-assemble technique[J].Analytica Chimica Acta,2005,534(2):223-229.

[8]WU Z S,LI J S,LUO M H,et al.A novel capacitive immunosensor based on gold colloid monolayers associated with a sol gel matrix[J].Analytica Chimica Acta,2005,528(2):235-242.

[9]胡瑞省,劉善堂,朱濤,等.金納米粒子通過形成Au—S鍵的組裝[J].物理化學學報,1999,15(11):961-965.HU Rui-tang,LIU Shan-tang,ZHU Tao,et al.Nano-gold formed compound through Au-S bond assembled[J].Acta Physico-Chimica Sinica,1999,15(11):961-965.(in Chinese)

[10]周德慶.微生物教程,2版[M].北京:高等教育出出版,2002.309-314.

[11]王文勇,李玉松,趙一玲,等.一種快速、穩定制備膠體金的新方法[J].細胞與分子免疫學雜志,1997,13(增刊1):18-19.(in Chinese)WANG Wen-yong,LI Yu-song,ZHAO Yi-ling,et al.A simple and fast method to preparation colloidal gold[J].Journal of Cellular and Molecular Immunology,1997,13(Suppl.1):18-19.

[12]張先恩.生物傳感器[M].北京:化學工業出版社,2005.368-369.