EZH2和P16基因在甲狀腺乳頭狀癌中表達的臨床意義

朱衛東 王鑫 張一兵

EZH2基因是新發現的一種癌基因，有促進細胞增殖作用［1］。P16蛋白為細胞周期蛋白依賴性激酶4(Cyclin-dependentinase 4，CDK4)抑制因子。它們都參與了多種惡性腫瘤的發生、發展，但EZH2與P16蛋白在甲狀腺乳頭狀癌表達相關性的研究筆者至今尚未見國內外報道。本研究利用免疫組化技術研究人類甲狀腺癌組織石蠟切片中EZH2和P16蛋白的表達及其相關性，從蛋白水平研究EZH2與P16在人類甲狀腺癌發生發展及預后中的作用。

1 材料與方法

1．1 材料 選擇2005年1月至2009年12月河北省唐山市人民醫院院普外科手術切除并經病理組織學確診的乳頭狀癌標本50例為惡性組織，另取甲狀腺瘤20例為對照。復閱上述患者的病理切片，重新切片。

1．2 試劑 一抗分別為鼠抗人EZH2單克隆抗體、P16單克隆抗體及免疫組化SP試劑盒為即用型，均為北京中杉生物公司產品。

1．3 免疫組化SP法檢測EZH2、P16基因表達 石蠟切片經二甲苯脫蠟和乙醇梯度脫水后，PBS沖洗3遍;每張切片滴加3%H2O2，阻斷內源性過氧化物酶活性，室溫孵育20 min;PBS沖洗3 min×3次;將切片放入pH值7．0 EDTA修復液微波抗原修復15 min，取出切片，自然冷卻至室溫，PBS緩沖液沖洗2遍;滴加一抗(EZH2 1∶150，P16 1∶50)，4℃ 過夜。陰性對照以PBS代替一抗。PBS沖洗3 min×3次;滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次;切片上滴加新鮮配制的DAB溶液，顯色3～5 min，顯微鏡下，觀察胞質和(或)胞核內出現棕黃色顆粒為陽性細胞;自來水沖洗，蘇木素復染，中性樹膠封片。

1．4 陽性結果判斷 EZH2及P16基因的陽性表達部位均主要在細胞核，陽性信號呈棕黃色。以陽性細胞占腫瘤細胞總數的比例和染色強度作為判斷依據，于高倍鏡下隨機取10個不同視野，各計數100個細胞觀察:無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;再按陽性細胞所占的百分比評分:陰性為0分，陽性細胞＜25%為1分，25% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分，兩分值的乘積＞3為陽性。

1．5 統計學分析 應用SPSS 10．0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P ＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 EZH2和P16蛋白在甲狀腺癌及甲狀腺瘤組織表達EZH2在甲狀腺癌組織表達高于甲狀腺瘤組織(48．0%與20．0%)，差異有統計學意義(P ＜0．05);P16蛋白在甲狀腺癌組織表達低于甲狀腺瘤組織(42．0%與75．0%)，差異有統計學意義(P ＜0．05)。見表1、圖 1～4。

表1 甲狀腺腫瘤中EZH2及P16基因表達結果比較 例(%)

圖1 EZH2在甲狀腺乳頭狀癌組織高表達(SP×200)

圖2 EZH2在甲狀腺瘤組織低表達(SP×200)

圖3 P16在甲狀腺乳頭狀癌組織低表達(SP×200)

圖4 P16在甲狀腺瘤組織高表達(SP×200)

2．2 EZH2和P16蛋白表達與甲狀腺癌臨床參數關系 Ⅰ期甲狀腺癌組織中EZH2表達低于Ⅱ～Ⅲ期(36．4%與70．6%)，P16表達高于Ⅱ～Ⅲ期(48．5%與29．4%)，但差異無統計學意義(P＞0．05);有淋巴結轉移的甲狀腺癌組織中EZH2表達高于無淋巴結轉移者(59．4%與27．8%)，P16表達低于無淋巴結轉移者(31．2 與61．1%)，差異有統計學意義(P ＜0．05);復發甲狀腺癌組織中EZH2表達高于無復發者(76．9%與37．8%)，P16表達低于無復發者(15．3%與51．4%)，差異有統計學意義(P ＜0．05)。見表2。

3 討論

細胞周期調控機制紊亂導致細胞的失控性生長是惡性腫瘤發生的共同特征，周期蛋白表達異常是導致細胞周期紊亂的重要原因之一［2］。EZH2基因是一個癌基因，屬于polycomb基因家族，該基因位于染色體7q35，該基因編碼一個746個氨基酸的多肽，含有SET結構域，具有組蛋白甲基轉移酶活性［3］。EZH2通過染色質修飾調控靶基因轉錄，作為轉錄抑制因子阻遏一些抑癌基因表達，使細胞周期抑制物質減少，細胞周期調控機制發生紊亂［4］。EZH2高表達可以促進細胞G1-S期轉化，使細胞過度增殖減少分化，從而導致惡性腫瘤的發生發展［5］。Raaphorst等［6］報道正常靜息期乳上皮細胞EZH2蛋白表達缺失，而在乳腺導管原位癌中EZH2蛋白表達已經開始增加，并表現出浸潤征象，將EZH2轉染正常永生化乳腺上皮細胞系H16N2后，EZH2蛋白表達增加，結果細胞表現出粘附非依賴性生長和侵襲性等惡性表型。在肝癌、膀胱癌等腫瘤研究中發現腫瘤組織中EZH2表達高于正常組織并與腫瘤的侵襲和轉移有關［7，8］。本實驗中，我們發現EZH2在甲狀腺癌組織中表達高于甲狀腺瘤組織，表明甲狀腺癌演變過程中存在EZH2的表達上調，而且在發生轉移的，甲狀腺癌組織中EZH2表達高于沒有發生轉移的，在復發的甲狀腺癌組織中EZH2表達高于沒有發生復發的，差異有統計學意義(P ＜0．05)，提示EZH2蛋白的表達上調與甲狀腺惡性腫瘤的形成及淋巴結的轉移有關，作為監測腫瘤轉移和復發危險性的客觀指標，有潛在的臨床應用價值。

表2 EZH2和P16蛋白的表達與甲狀腺癌臨床病理參數的關系例(%)

P16基因是抑癌基因，位于人染色體9p21，其編碼蛋白是細胞周期監控、驅動機制中最主要的調控蛋白。P16蛋白是CDK4抑制因子，由于CDK4在細胞增殖和惡性轉化過程中起重要作用，參與了多種腫瘤的發生或發展，因此P16基因被稱為多重腫瘤抑癌基因［9］。當P16基因由于缺失、突變和甲基化導致表達降低時，對CDK4抑制減弱，就會導致細胞無限的增殖、惡變。有文獻報道P16表達增加的肺癌細胞被阻滯在G1期，無法進入S期［10］。本實驗檢測了50例甲狀腺癌和20例甲狀腺瘤組織，結果顯示甲狀腺癌組織P16表達低于甲狀腺瘤組織，而且發生轉移和復發的甲狀腺癌組織中P16表達均低于沒有轉移和沒有復發者，與文獻報道相符［11］，提示P16的表達降低可能與甲狀腺癌的惡性轉化有關，檢測甲狀腺癌組織P16的表達變化對預后評估和病理鑒別診斷有一定指導意義。

腫瘤的發生是一個多因素、多步驟的發展過程，是多基因共同作用的結果，EZH2的高表達和P16蛋白低表達與甲狀腺癌的發生、發展、浸潤、轉移有關。聯合檢測EZH2和P16蛋白表達可以在一定程度上預測甲狀腺癌患者的預后，對更好地理解甲狀腺癌的惡變機制以及綜合評價其對患者預后的影響可能更具臨床價值。

1 Bachmann IM，Ole J，Colle HK，et al．EZH2 Expression Is Associated With High Proliferation Rate and Aggressive Tumor Subgroups in Cutaneous Melanoma and Cancers of the Endometrium，Prostate，and Breast．Journal of Clinical Oncology，2003，24:268-273．

2 宋愛林．甲狀腺乳頭狀癌68例臨床分析．河北醫藥，2008，31:1565．

3 Chen H，Rossier C，Antonarakis SE．Cloning of a human homolog of the Drosophila enhancer of zeste gene(EZH2)that maps to chromosome21q2212．Genomics，1996，38:30-37．

4 Varambally S，Dhanasekaran SM，Zhou M，etal．The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer．Nature，2002，419:624-629．

5 Bracken AP，Pasini D，Capra M，et al．EZH2 is downstream of the pRBE2F pathway，essential for proliferation and amplifiedin cancer．Embo J，2003，22:5323-5335．

6 Raaphorst FM，Meijer CJ，Fieret E，et al．Poorly differentiated breast carcinoma is associated with increased expression of human polycomb group EZH2 gene．Neoplasia，2003，5:481-488．

7 Raman JD，Nigel P，Mongan D，et al．Increased Expression of the Polycomb Group Gene，EZH2，in Transitional Cell Carcinoma of the Bladder．Clin Cancer Res，2005，11:8570-8576．

8 Sudo T，Utsunomiyal T，Mimori1 K，et al．Clinicopathological ignificance of EZH2 mRNA expression in patients with hepatocellular carcinoma．British Journal of Cancer，2005，92:1754-1758．

9 周清華，石應康，侯梅，等．人非小細胞肺癌P16基因突變研究．中國胸心血管外科臨床雜志，1997，4:67-69．

10 Spruck CH，Johnson DG，Schwart JK，et al．P16 gene in uncultured tumours．Nature，1994，370:183-184．

11 Tung WS，Shevlin DW，Bartsh D，et al．Infrequent CDKN2 mutation in human differentiated thyroid cancers．Mol Carcinology，1996，15:51．