東海海參多糖酶解提取工藝優化

徐 逯，葉立斌，于 平，勵建榮*

(浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州 310035)

東海海參多糖酶解提取工藝優化

徐 逯，葉立斌，于 平，勵建榮*

(浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州 310035)

將現代酶解技術應用于東海海參多糖提取工藝，選取胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶進行酶解，通過單因素試驗確定最佳蛋白酶為胃蛋白酶，并通過響應面分析方法以多糖得率為響應值優化酶解工藝。結果表明，酶解工藝最優條件為胃蛋白酶用量(m/m)0.95%、酶解溫度56℃、酶解時間6h、酶解液pH1。在此條件下海參多糖得率為1.65%，該值與響應面模型的預測值1.59%基本相符。

東海海參；多糖；蛋白酶；響應面分析

東海海參(Acaudina molpadioides Semper)，又名海茄子，屬于棘皮動物門(Echinodermata)，海參綱(Holothurioider)，生長于海洋底層巖石上或海藻間，為海洋中重要的食物和藥物資源。其蘊藏量相當豐富，目前約為106噸。由于受加工技術的限制，東海海參深加工的產業鏈發展相對滯后，因而漁民即使捕獲也放歸大海[1]。研究表明，海參體壁所含的一種酸性黏多糖是一種有別于一般多糖類的含有糖醛酸和氨基糖殘基的多糖[2]，海參黏多糖是一類高度硫酸酯化并經巖藻糖基側鏈修飾的軟骨素型聚糖[3]，海參酸性黏多糖具有降血壓、抗癌作用[4-7]、提高機體細胞免疫功能[8-9]，對抗新生血管形成等[10-11]。因此，本實驗對東海海參多糖的提取工藝進行研究，為進一步的海參酸性黏多糖提取打下基礎。

以東海海參為原料，采用酶解技術，對酶解過程中的溫度、時間、pH值、加酶量等條件進行研究，運用響應面分析法優化東海海參多糖提取工藝，為東海海參的進一步開發提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東海海參 寧海縣東部海洋經濟開發有限公司；胰蛋白酶(262U/g)、胃蛋白酶(3000～3500NFU/mg)、木瓜蛋白酶(52U/mg) Sigma公司。

1.2 儀器與設備

UV-2550型紫外-可見光分光光度計 Shimadzu公司；Forma-86C型超低溫冰箱 Thermo Electron公司；DZG-6090型真空干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；高速離心機；Delta320型pH酸度計 Mettler Toledo公司；HH-2、HH-6型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 東海海參酶解前處理工藝

工藝流程：東海海參→水發除鹽→切碎→冷凍干燥→堿解→酶解→離心除沉淀→海參多糖酶解液

工藝要點：1)水發除鹽：用自來水常溫浸泡16h，使干海參膨脹，并使其所含鹽分降低。2)切碎：東海海參表面積的大小會影響酶解效果，將東海海參切成塊狀即可。3)冷凍干燥：為計算精確的多糖得率，將原料冷凍干燥后進行酶解。4)堿解：以6倍0.5mol/L的K2CO3在60℃條件下堿解1.5h。5)酶解：加入一定量的蛋白酶，保持一定的酶解時間，通過苯酚硫酸法，以多糖得率為指標確定最佳酶解工藝。

1.3.2 酶水解工藝路線

將原料用粉碎機粉碎，取5g，以30mL 0.5mol/L K2CO3在60℃條件下堿解1.5h，然后用6mol/L HCl調pH值后進行酶解，以多糖得率為指標，分別改變溶液pH值、加酶量、溫度、時間4個因素對蛋白酶的種類及各個條件進行優化。苯酚硫酸法[12]測定多糖含量，計算多糖得率。

1.3.3 多糖得率的計算

式中：多糖質量濃度通過苯酚硫酸法[12]測定。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶種類對酶解效果的影響

蛋白酶種類對糖蛋白的作用有一定影響，進而影響酶解效果。取相同量的東海海參粉末，在酶用量0.4%、溫度50℃條件下酶解4h，考察不同蛋白酶對酶解效果的影響，結果見表1。

表1 蛋白酶種類對酶解效果的影響Table1 Effect of proteases on polysaccharide yield

由表1可見，在酶用量相同的情況下，以胃蛋白酶作用后的多糖得率為最高，可以達到1.2%，這是由于胃蛋白酶是一種酸性蛋白酶，能分解蛋白質中由芳香族氨基酸或酸性氨基酸所形成的肽鍵，故能催化酪蛋白、球蛋白、組蛋白，動物的角、指甲和羽毛中的角蛋白，以及催化植物蛋白等的水解，而胰蛋白酶只斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵，重金屬離子、有機磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制劑對其活性有強烈抑制，木瓜蛋白酶對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強的水解能力，同時，還具有合成功能，能把蛋白水解物合成為類蛋白質[13]。由于本實驗所用原料為海產品，所以其中所含物質會對胰蛋白酶造成抑制，而木瓜蛋白酶的蛋白合成作用會對多糖得率有一定影響，所以有此確定蛋白酶的選取為胃蛋白酶，進而對其酶解條件進行進一步優化，以期達到最高得率。

2.2 酶解時間對胃蛋白酶酶解效果的影響

圖1 酶解時間對多糖得率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis duration on polysaccharide yield

由圖1可知，隨著酶解的進行，海參中的蛋白質不斷降解為肽和氨基酸與糖鏈分離，多糖得率隨之增加，但酶解時間過長會使酶解液腐敗并使成本增加，理論上講，在反應進行到一定程度后，隨著底物減少，酶活力下降，酶解也會趨于平緩。因此，以多糖得率來確定最優酶解時間為6h。

2.3 酶用量對胃蛋白酶酶解效果的影響

圖2 酶用量對多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzyme load on polysaccharide yield

在確定酶解時間6h后，固定pH2，溫度50℃條件下，對加酶量進行選擇。結果見圖2。

由圖2可知，樣品酶解時隨著胃蛋白酶用量的增加，海參多糖的得率呈逐漸上升趨勢，當胃蛋白酶用量(m/m)超過0.8%時，得率開始呈現下降的趨勢，這可能是由于酶與底物之間的濃度達到飽和，再增加酶用量，酶解作用較小。因此，選擇酶用量為0.8%。

2.4 pH值對胃蛋白酶酶解效果的影響

酶解時，pH值過低或過高都會影響胃蛋白酶的活性。在酶解時間6h、加酶量0.8%、溫度50℃條件下酶解，考察不同pH值對多糖得率的影響，結果見圖3。

圖3 pH值對多糖得率的影響Fig.3 Effect of initial pH on polysaccharide yield

由圖3可見，pH值由0.5增至1時多糖得率有所增加，當pH值達到1后，隨著pH值的增加，多糖得率逐漸減少。這是因為胃蛋白酶是酸性蛋白酶，在酸性條件下活性最強，隨著pH值的增加其活性會受到抑制，而鹽酸用量過多會對多糖進行降解，因此，選擇pH1進行酶解。

2.5 酶解溫度對胃蛋白酶酶解效果的影響

每種蛋白酶都有各自的最適作用溫度，溫度過低或者過高都會影響其活性。在pH1、加酶量0.8%條件下酶解6h，考察不同酶解溫度對多糖得率的影響，結果見圖4。

圖4 酶解溫度對胃蛋白酶酶解效果的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on polysaccharide yield

由圖4可知，在40～55℃酶解溫度范圍內，隨著酶解溫度的升高，海參多糖得率逐漸增加；酶解溫度大于55℃時，再增加酶解溫度，多糖得率呈現下降趨勢。酶解溫度對酶催化反應的影響是多方面的，包括對酶催化反應的速度和對酶穩定性的影響。溫度升高時，酶催化反應的速度大大加快，而酶的穩定性隨著酶解溫度升高而變差，當這兩種效應達到平衡時即為酶的最適溫度，酶活力最大[14]。最適酶解溫度為55℃。

2.6 采用響應面法優化胃蛋白酶酶解工藝條件

2.6.1 分析因素的選取及分析方案

根據Box-Benhnken模型的中心組合試驗設計原理[15]，選取海參多糖提取的酶解時間(A)、酶解溫度(B)、pH值(C)、酶用量(D)為自變量，多糖得率為響應值，試驗因素及水平設計見表2。

表2 響應面法分析因素及水平Table2 Factors and levels in the response surface design

2.6.2 響應面分析與試驗結果

表3 響應面分析方案及試驗結果Table3 Response surface design layout and experimental results

取27個試驗點，分為24個析因點和3個零點。其中析因點為自變量，取值在A、B、C、D所構成的三維頂點上；零點為區域的中心點，零點重復3次，以估計試驗誤差。試驗設計及結果見表3。

2.6.3 模型的建立與顯著性檢驗

采用Design 7.0軟件對表3中的試驗數據進行多元回歸擬合，得回歸方程：

R= 1.36－0.049a＋0.040b－0.17c＋0.16d－0.071ab＋0.19ac－0.006357ad－0.12bc＋0.055bd－0.18cd－0.21a2－0.23b2－0.12c2－0.29d2

式中：a=(A－6)/2，b=(B－55)/10，c=(C－2)/1，d=(D－0.8)/0.4；a、b、c、d為編碼值，A、B、C、D為真實值，R為多糖得率/%。

對模型系數顯著性檢驗結果見表4，模型的方差分析結果見表5。

表4 模型回歸系數顯著性檢驗和結果Table4 Significance test for regression coefficients of the established regression model

表5 模型檢定結果的分析Table5 Results of statistical evaluation of the established regression model

由表4、5可知，試驗模型對試驗擬合良好，模型P=0.0178＜0.05，表明該試驗模型顯著。失擬項P= 0.0571＞0.05，說明方程對試驗的擬合度較好，此方法可靠。表5表明各因素對多糖得率的影響不同，其中酶解pH值影響最大，酶用量次之，均達極顯著水平；酶解溫度、酶解時間對多糖得率無顯著影響；酶用量與酶解溫度的交互項達到顯著水平。

2.6.4 響應面分析圖

通過多元回歸方程分析得知4個因素及其交互作用對多糖得率的影響情況。該影響可以用響應曲面和等高線來表示。圖5～10分別表示酶解溫度與酶解時間、酶解pH值與酶解時間、酶解加酶量與酶解時間、酶解pH值與酶解溫度、酶解加酶量與酶解溫度、酶解加酶量與酶解pH值，6組因素對海參多糖胃蛋白酶酶解效果的影響。

圖5 多糖得率=f(A,B)的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis temperature and duration

圖6 多糖得率=f(A,C)的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis duration and initial pH

圖7 多糖得率=f(A,D)的響應面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis duration and enzyme load

圖8 多糖得率=f(B,C)的響應面和等高圖Fig.8 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis temperature and initial pH

圖9 多糖得率=f(B,D)的響應面和等高圖Fig.9 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis temperature and enzyme load

圖10 多糖得率 =f(C、D)的響應面和等高圖Fig.10 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of enzyme load and initial pH

RSM圖形是指在其他因素水平固定的條件下，響應值與試驗中兩因素所構成的三維曲面圖，可直觀地反映各因素之間的相互作用對響應值的影響。圖5～10直觀的給出了各個因素交互作用響應面的3D圖和等值線圖。從響應面的最高點和等值線可以看出，在所選范圍內存在極值。

2.6.5 最佳酶解條件

由Design軟件的嶺脊分析得到海參多糖的最佳酶解條件，即酶解時間5.42h，酶解溫度56.19℃，酶解液pH1.12，胃蛋白酶用量0.95%。在此條件下海參多糖的得率為1.59%。為檢驗RSM法的可靠性，采用上述最佳酶解條件做驗證實驗。考慮到實際操作，將最佳酶解條件修正為酶解時間6h、酶解溫度56℃、酶解液pH1、胃蛋白酶用量0.95%。在此條件下海參多糖得為1.65%。與理論預測值基本相符，說明該回歸方程能較真實地反映各因素對海參多糖酶解效果的影響情況。

3 結 論

用胃蛋白酶提取海參多糖，獲得具有較高多糖得率的酶解液，為海參酸性黏多糖的制備提供研究基礎。利用響應面分析得出優化的酶解工藝條件為酶解時間6h、酶解溫度56℃、酶解液pH1、胃蛋白酶用量0.95%，在此最優工藝條件下，多糖得率可達到1.65%，該值與響應面模型的預測值1.59%基本相符，說明響應面模型可優化酶解工藝條件。

[1]王方國, 張海生, 姚玨, 等. 一種海洋低值生物資源: 香參的開發技術研究[J]. 海洋科學, 1997(5): 67-69.

[2]MINALE L, LORIZZI M, PALAGIANO E, et al. Steroid and triterpenoid oligoglycosides of marine origin[J]. Adv Exp Med Biol, 1996, 404: 335-356.

[3]樊繪曾. 粘多糖及其提取分離[J]. 海洋藥物, 1983(1): 40.

[4]樊繪曾. 海參: 海中人參: 關于海參及其成分保健醫療功能的研究與開發[J]. 中國海洋藥物, 2001(4): 37-44.

[5]馬克韶, 郝曉閣, 王莉. 刺參酸性粘多糖抗腫瘤肺轉移的實驗研究[J]. 海洋藥物雜志, 1982(1): 72.

[6]樊繪曾, 陳菊娣, 呂培宏, 等. 刺參內臟酸性粘多糖研究[J]. 海洋藥物, 1983(3): 134-137.

[7]王振立, 劉桂敏, 鄭瑞, 等. 刺參酸性粘多糖抑制小鼠腫瘤細胞DNA合成及其代謝研究[J]. 中國醫藥工業雜志, 1993, 24(9): 405-408.

[8]ODINSTSOVA N A, NESTEROW A M, KOROHAGINA D A. A growth factor from tssues of the muscle Mytilus edulis[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology, 1993, 105(4): 667-671.

[9]李惟敏, 主述恒, 粱袖勤, 等. 刺參酸性粘多糖對肌體免疫功能的影響[J]. 腫瘤臨床, 1987(12): 118.

[10]孫玲, 徐迎輝, 許華臨. 刺參酸性粘多糖對細胞免疫的增強作用[J].生物化學與生物物理進展, 1991, 18(5): 394-395.

[11]梁延杰, 魏樹郡. 刺參酸性粘多糖對小鼠移植性肺癌作用的病理組織學與超微結構觀察[J]. 中西醫結合雜志: 基礎理論研究特集, 1988: 61.

[12]胡居吾, 范青生, 肖小年. 粗多糖測定方法的研究[J]. 食品科技, 2006 (2): 16-18.

[13]LIU Wanshun, TANG Yanlin, LIU Xuewu, et al. Studies on the preparation and on the properties of sea snaile nzymes[J]. Hydrobiologia, 1984, 116/117(1): 319-320.

[14]王文高, 陳正行, 姚惠源. 不同蛋白酶提取大米蛋白質的研究[J]. 糧食與飼料工業, 2002(2): 41-42.

[15]費榮昌. 試驗設計與數據處理[M]. 4版. 無錫: 江南大學出版社, 2001: 59-63.

Optimization of Enzymatic Polysaccharide Extraction from Acaudina molpadioides Semper by Response Surface Methodology

XU Lu，YE Li-bin，YU Ping，LI Jian-rong*
(Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)

Papain, pepsin and trypsin were chosen to conduct the single enzyme hydrolysis of Acaudina molpadioides Semper for polysaccharide extraction, and pepsin was the selected enzyme due to the highest polysaccharide yield. The hydrolysis of Acaudina molpadioides Semper with pepsin was optimized by response surface methodology in order to improve polysaccharide yield. The optimal conditions for pepsin hydrolysis were found to be: enzyme load, 0.95%; hydrolysis temperature, 56 ℃; initial pH, 1; and hydrolysis duration, 6 h. An experimental polysaccharide yield of 1.65% was obtained under these conditions, which basically accorded with the model predicted value of 1.59%.

Acaudina molpadioides Semper；polysaccharide；enzymoysis；response surface methodology

TQ929.2

A

1002-6630(2010)20-0061-06

2010-01-07

徐逯(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為功能因子。E-mail：xuluyaya12345@126.com

*通信作者：勵建榮(1964—)，男，教授，博士，研究方向為農產品、水產品貯藏加工與安全控制。E-mail：lijianrong@zjgsu.edu.cn