酒類主要風味物質對乙醇-水體系中氫鍵的影響

鄭飛云，姜 甜，董建軍，單連菊，李 崎,*，顧國賢

(1. 江南大學 教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.青島啤酒股份有限公司科研中心，山東 青島 266101)

酒類主要風味物質對乙醇-水體系中氫鍵的影響

鄭飛云1，姜 甜1，董建軍2，單連菊2，李 崎1,*，顧國賢1

(1. 江南大學 教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.青島啤酒股份有限公司科研中心，山東 青島 266101)

研究酒類主要風味物質對乙醇-水體系中的氫鍵締合影響。Plackett-Burman試驗可知，異丁醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、KCl、NaCl、MgSO4、蘋果酸、乳酸、丙酮酸對乙醇-水體系中氫鍵締合影響最大。根據相關性分析，酒精度與啤酒中氫鍵締合強度的相關系數為0.629，是主要影響因素；原麥汁濃度、異丁醇、氯離子、鉀離子、丙酮酸、乳酸與氫鍵締合均有一定的正相關性。

氫鍵；乙醇-水；啤酒；核磁共振(NMR)

氫鍵是廣泛存在的分子級弱作用力，在水及其溶液、醇、羧基溶劑、無機酸、酸堿式鹽、碳水化合物、氨和氨合物、酰胺、氨基酸、蛋白質等物質中扮演著重要角色[1]。含醇體系存在非常復雜的締合作用，包括醇自締合、與水締合及與其他化合物交叉締合。醇水溶液中，1H-NMR化學位移能反映水水、水醇、醇醇之間氫鍵結構的一般特性和氫鍵所處環境[2]。氫鍵X—H…Y形成時，由于質子接受體(Y)存在，形成的靜電場將H拉向Y，而將X—H鍵的電子推向X，使H周圍電子云密度降低，去屏蔽效應增加，因此質子化學位移向低場移動[3]。

乙醇和水都是締合液體，分別具有不同的締合結構群，混合后形成新的締合結構[4-6]，隨乙醇-水物質的量濃度及溫度等不同而變化，其締合程度可用1H-NMR譜中質子化學位移來量度，質子化學位移越大，締合度越大[7]。Coccia等[5]認為在水中加入少量醇會強化氫鍵締合，并形成新的醇水氫鍵。當乙醇物質的量分數(f)增加到0.25＜f＜0.75甚至更高(＞0.8)時，會破壞水結構。25℃乙醇水溶液中，乙醇體積分數為20%時的物質的量分數為0.077，此時水分子締合度最高。乙醇體積分數為20%水溶液中，幾乎所有鹽類(除了MgCl2和KF)都會減弱氫鍵締合，使化學位移向高場移動[2]。通過1H-NMR化學位移發現：酸能解離出質子并加強醇水氫鍵締合[2]，而共軛基團陰離子(質子受體)可以結合解離出的質子[2]。酚類物質能促進醇水之間質子交換，苯酚和焦酚能使羥基質子峰向低場微弱移動，而多酚和苯羧基酸能使羥基質子峰向低場強烈移動[2]，均能不同程度加強醇水溶液中氫鍵締合。

酒精飲料是一種具有特殊風味和口感的醇水溶液。根據國內外對白酒[8]、米酒[9]、蒸餾酒[10]、日本清酒[11]、威士忌[12]等酒的研究，醇、水結構變化對酒類口感有較大影響[11]，酒入口刺激感降低，變得柔和綿軟，與醇水結構變化有關，而醇水含量和結構又與氫鍵締合有關[13]。啤酒中乙醇和水約占95%，其混合體系主要以氫鍵形式發生締合[13]。當然，由于啤酒中醇、酯、酚、酸等物質含有大量強極性氫原子和電負性大的氧原子，也能形成大量的氫鍵[14]。目前人們只是初步確定醇、酯、有機酸、離子等對醇水氫鍵締合有一定影響，但并未確定對氫鍵締合影響的主次和差異。本實驗主要研究各風味物質對乙醇-水和啤酒體系氫鍵締合影響的大小，旨在為酒精飲料中氫鍵締合的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售35種不同品牌啤酒。

草酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、β-苯乙醇、乙酸異戊酯、異戊醇、甲醇、DSS[(CH3)3Si-(CH3)3-SO3Na]、3-庚酮均為色譜級；無水乙醇(純度99.7%)、30%硫酸鋅溶液、15%亞鐵氰化鉀溶液、硝酸銀、鹽酸、氯化鋇、氯化鈉、濃硝酸、超純水、KCl、MgSO4、MgCl2、Na2SO4、K2SO4、CaCl2、NaOH、D2O均為化學純。

1.2 儀器與設備

Avance AV-500型核磁共振波譜儀 瑞士Bruker公司； Shimadzu GC-2010氣相色譜儀 日本島津公司；高效液相色譜和Sep-Pak C18Cartridge樣品處理柱 美國Waters公司； SpectraAA220原子吸收分光光度計 美國Varian公司；K、Na、Mg、Zn、Ca空心陰極燈 北京威格拉斯有限公司；PHS-3C型精密pH計；UV-2000分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 乙醇-水體系的制備

用超純水將99.7%的無水乙醇調配成質量分數為3.5%的乙醇溶液，依Plackett-Burman試驗要求，分別在3.5%乙醇溶液中添加不同量的有機酸、高級醇和酯、鹽類物質，制備不同風味物質含量的乙醇-水體系。

1.3.2 啤酒體系的NMR測定

35種啤酒樣品(表1)經過濾脫氣處理，將樣品和D2O加到12cm一端封口熔點毛細管內，置于Avance AV-500型核磁共振波譜儀核磁檢測測定。測定條件：氫核共振頻率500.130MHz；5mm QNP(四核探頭13C-1H-31P-19F)探頭；D2O鎖場；內標物質DSS[(CH3)3Si-(CH2)3-SO3Na]；檢測溫度18℃。

表1 35種市售啤酒的特性Table 1 Characteristics of 35 kinds of beer samples

1.3.3 高級醇和酯的測定

靜態頂空自動進樣氣相色譜檢測，在頂空瓶中加入1.8g NaCl和4mL啤酒樣品，并加入1mL 30mg/L內標3-庚酮，在水浴鍋中微熱使NaCl充分溶解。

色譜分析條件：色譜柱CP-WAX 52 CB(30m× 0.32mm，0.52μm)；載氣N2；色譜柱室溫40℃保持2min，以10℃/min升到180℃保持4min；氣化室溫度200℃；檢測室溫度250℃；進樣時間0.04min；頂空瓶平衡時間30min；頂空瓶平衡溫度70℃；傳輸線溫度130℃。

1.3.4 無機離子的測定

參照文獻[15]的方法測定。

1.3.5 有機酸的測定

采用高效液相色譜法[16]。

1.3.6 酒精度、原麥汁濃度、真實麥芽汁濃度、總酸的測定

參照文獻[17]的方法測定。

2 結果與分析

2.1 風味物質對乙醇-水體系氫鍵的影響

Plackett-Burman試驗設計是一種二水平的部分因子設計方法，基于非完全平衡塊原理，能用最少試驗次數估計出因素的主效應，從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素。以Nose等[2]報道的成分為單因素，結合啤酒中的含量范圍進行Plackett-Burman試驗。

表2 有機酸的Plackett-Burman試驗設計及響應值表Table 2 Experimental design and response values of Plackett-Burman for organic acids

表4 醇和酯的Plackett-Burman試驗設計及響應值表Table 4 Experimental design and response values of Plackett-Burman for alcohol and ester

2.1.1 有機酸對乙醇-水氫鍵的影響

大多數有機酸均能不同程度地促進乙醇-水體系中氫鍵的締合，但在混合體系中并不知道究竟是哪些有機酸對氫鍵的締合起主要作用，為此，設計n=12的Plackett-Burman試驗篩選主要影響因素。試驗設計及響應值如表2所示，結果如表3所示。

表3 有機酸試驗因素水平及其主效應分析Table 3 Factors, levels and major response-effect analysis of Plackett-Burman experiments for organic acids

由表3可知，有機酸相關性大小排序為：蘋果酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸，決定系數R2為95.93%，前3個因素的可信度都在80%左右，即有機酸中蘋果酸對乙醇-水締合氫鍵影響最大，乳酸、丙酮酸次之。

2.1.2 高級醇和酯對乙醇-水體系中氫鍵的影響

表5 醇和酯試驗因素水平及其主效應分析Table 5 Factors, levels and major response-effect analysis of Plackett-Burman experiments for alcohol and ester

表6 鹽類的Plackett-Burman試驗設計及響應值表Table 6 Experimental design and response values of Plackett-Burman experiments for salts

醇和酯分子中含有電負性大的氧原子，易于形成氫鍵，并且能對乙醇和水之間的羥基氫鍵產生影響。設計n=12的Plackett-Burman試驗篩選主要影響因素。試驗設計及響應值如表4所示，結果如表5所示。

由表5可知，醇和酯相關性大小排序為：異丁醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、正丙醇、乙酸異戊酯、異戊醇，決定系數R2為89.09%，前3個因素的可信度在80%左右，即異丁醇對乙醇-水體系中氫鍵的影響最大，β-苯乙醇、乙酸乙酯次之。

2.1.3 鹽類對乙醇-水體系中氫鍵的影響

大部分的鹽類除了(MgCl2和KF)都會減弱氫鍵結構的締合，使化學位移向高場處移動。鹽類對乙醇-水體系中氫鍵結構的影響與結晶離子半徑和離子電荷有關。設計n=12的Plackett-Burman試驗篩選主要影響因素。試驗設計及響應值如表6所示，結果如表7所示。

由表7可知，鹽類相關性大小排序為：K C l、NaCl、MgSO4、MgCl2、Na2SO4、K2SO4、CaCl2，決定系數R2為97.91%，前3個因素的可信度在85%左右，即鹽類物質中KCl對乙醇-水體系中締合氫鍵的影響最大，NaCl、MgSO4的影響次之。

表7 鹽類試驗因素水平及其主效應分析Table 7 Factors, levels and major response-effect analysis of Plackett-Burman experiments for salts

表8 醇和酯含量與質子化學位移的Pearson相關矩陣(相關系數)Table 8 Pearson correlation matrix of alcohol and ester contents to proton chemical shift

2.2 風味物質對啤酒體系締合氫鍵的影響

2.2.1 醇和酯與啤酒體系氫鍵締合的相關性

以1.3.3節和1.3.6節的實驗方法測定35種啤酒中的乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、異戊醇、酒精度、真實麥芽汁濃度、原麥汁濃度，并以其為自變量。用1.3.2節的方法測定35種啤酒中質子化學位移，并以其為因變量。用SPSS軟件做Pearson相關分析，結

果見表8。啤酒中質子化學位移與酒精度的相關性系數為0.629，且在0.01水平上顯著，說明酒精度是影響質子化學位移的主要因素，因為乙醇是啤酒中除水外含量最多的成分，且乙醇分子較小，空間結構簡單，含有強極性的羥基質子和電負性大的氧原子。原麥汁濃度、異丁醇、異戊醇、正丙醇與質子化學位移有較大的正相關性，酯類物質與質子化學位移的相關性較小，推測可能是與它們特有的羥基和羰基結構有關。

為了更加直觀的反映各單因素對啤酒羥基質子締合的影響，考察醇和酯各主要因素與羥基質子化學位移的相關性擬合曲線及方程，結果見圖1～3。酒精度、原麥汁濃度、異丁醇質量濃度均與質子化學位移呈正相多項式相關，擬合度分別為0.7487、0.6672、0.6362，說明該方程能較好的擬合自變量與因變量之間的關系。

圖1 酒精度與質子化學位移相關性擬合曲線Fig.1 Fitting curve between alcohol concentration and proton chemical shift

圖2 原麥汁濃度與質子化學位移相關性擬合曲線Fig.2 Fitting curve between original wort concentration and proton chemical shift

圖3 異丁醇質量濃度與質子化學位移相關性擬合曲線Fig.3 Fitting curve between isobutanol and proton chemical shift

表9 無機離子質量濃度與質子化學位移的Pearson相關矩陣(相關系數)Table 9 Pearson correlation matrix of inorganic ion contents to proton chemical shift

2.2.2 無機離子與啤酒體系氫鍵締合的相關性

以1.3.4節的方法測定35種啤酒的K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Cl－、SO42－無機離子，以其為自變量。用1.3.2節的方法測定35種啤酒中質子化學位移，以其為因變量，用SPSS軟件做Pearson相關分析，結果見表9。質子化學位移與Cl－、K+有較大的正相關性，而SO42－、Na+成負相關性，與Mg2+、Ca2+的相關性較小，推測無機離子對啤酒中氫鍵結構的影響與結晶離子半徑和離子電荷有關。

為了更加直觀的反映各單因素對啤酒羥基質子締合的影響，考察無機離子各主要單因素與羥基質子化學位移的相關性擬合曲線及方程，結果見圖4、5。C l－、K+均與質子化學位移成正相多項式相關，擬合度分別為0.562、0.5364，說明該方程能較好的擬合自變量與因變量之間的關系。

圖4 Cl-質量濃度與質子化學位移相關性擬合曲線Fig.4 Fitting curve between Cl-and proton chemical shift

圖5 K+質量濃度與質子化學位移相關性擬合曲線Fig.5 Fitting curve between K+and proton chemical shift

表10 有機酸含量與質子化學位移的Pearson相關矩陣(相關系數)Table 10 Pearson correlation matrix of organic acid contents to proton chemical shift

2.2.3 有機酸與啤酒體系氫鍵締合的相關性

以1.3.5、1.3.6節的方法測定35種啤酒中9種有機酸和總酸含量，以其為自變量。用1.3.2節的方法測定35種啤酒的質子化學位移，以其為因變量，用SPSS軟件做Pearson相關分析，結果見表10。

由表10可知，啤酒中質子化學位移與丙酮酸的相關系數為0.595，在0.01水平上極顯著，說明丙酮酸也是影響啤酒氫鍵締合的重要因素，因為丙酮酸分子結構簡單，具有弱酸性的羧基和極性較大的羰基，并且其羧羥基質子容易解離，易于形成較穩定的強氫鍵；與乳酸的相關性系數為0.515，在0.01水平上顯著，對啤酒氫鍵締合也有較大的影響，乳酸分子中含有弱酸性易解離的羧基和醇羥基，也易于氫鍵的形成；與檸檬酸和酮戊二酸有較小的正相關性，與其他酸的相關性并不大。推測酸類物質影響羥基質子化學位移的變化可以歸結為未解離的酸分子(HA)和解離的H+。同時，酸類物質對質子化學位移的作用在一定程度上取決于酸度，酸通過解離出質子(質子供體)使乙醇-水體系中氫鍵締合加強，而共軛基團陰離子(質子受體)可以結合解離出的質子。

為了更加直觀的反映各單因素對啤酒羥基質子締合的影響，考察有機酸的各主要因素與羥基質子化學位移的相關性擬合曲線及方程，結果見圖6、7。

圖6 丙酮酸質量濃度與質子化學位移相關性擬合曲線Fig.6 Fitting curve between pyruvic acid and proton chemical shift

圖7 乳酸質量濃度與質子化學位移相關性擬合曲線Fig.7 Fitting curve between lactic acid and proton chemical shift

丙酮酸、乳酸均與質子化學位移成正相多項式相關， 擬合度分別為0.7237、0.7264，說明該方程能較好的擬合自變量與因變量之間的關系。

3 結 論

3.1 由Plackett-Burman試驗可知，高級醇和酯對乙醇-水體系氫鍵締合影響大小排序為：異丁醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、正丙醇、乙酸異戊酯、異戊醇，決定系數R2為89.09%，前3個因素可信度在80%左右。有機酸對乙醇-水體系氫鍵締合影響大小排序為：蘋果酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸，決定系數R2為95.93%，前3個因素可信度在80%左右。鹽類對乙醇-水體系氫鍵締合影響大小排序為：KCl、NaCl、MgSO4、MgCl2、Na2SO4、K2SO4、CaCl2，決定系數R2為97.91%，前3個因素可信度在85%左右。

3.2 啤酒中質子化學位移與酒精度相關性系數為0.629，在0.01水平上顯著，說明酒精度是影響質子化學位移的主要因素。原麥汁濃度、異丁醇、異戊醇、正丙醇與質子化學位移有較大的正相關性，酯類物質與質子化學位移的相關性較小。啤酒中質子化學位移與Cl－、K+有較大正相關性，而與SO42－、Na+成負相關性，與Mg2+、Ca2+相關性較小。啤酒中質子化學位移與丙酮酸和乳酸

的相關系數分別為0.595和0.515，在0.01水平上顯著，說明它們是影響啤酒氫鍵締合的重要因素；與檸檬酸和酮戊二酸正相關性較小，與其他酸相關性不大。

3.3 各風味物質對乙醇-水體系和啤酒體系羥基質子氫鍵締合的影響大小并不完全相同，高級醇和酯中異丁醇對兩種體系均有較大影響；離子中Cl－、K+對兩種體系均有較大影響；有機酸中丙酮酸、乳酸對兩種體系均有較主要影響，而其他物質對兩種體系的影響各不相同。推測啤酒體系是由大量物質組成的膠體，氫鍵締合強度受各種物質的相互影響，是相互作用的結果，與乙醇-水體系有所不同。

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Effect of Flavor Substances on Hydrogen Bonds of Water-ethanol System

ZHENG Fei-yun1，JIANG Tian1，DONG Jian-jun2，SHAN Lian-ju2，LI Qi1,*，GU Guo-xian1
(1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. Center of Research and Development, Tsingtao Brewery Co. Ltd., Qingdao 266101, China)

The effect of major flavor compounds in wine on hydrogen bonds of water-ethanol system was studied. Plackett-Burman experiments confirmed that hydrogen bonds of water-ethanol system were greatly affected by isobutanol, β-phenylethyl alcohol, ethyl acetate, KCl, NaCl, MgSO4, malic acid, lactic acid and pyruvic acid. Correlation analysis indicated that coefficient between alcohol concentration and hydrogen bond intensity was 0.629. Therefore, alcohol concentration was the primary factor to hydrogen bond intensity although original wort concentration, isobutanol, Cl－, K+, pyruvic acid and lactic acid also exhibited an influence on hydrogen bond intensity to some extent.

hydrogen bond；water-ethanol system；beer；NMR

TS201.2

A

1002-6630(2010)09-0106-07

2009-05-22

鄭飛云(1974—)，男，講師，本科，主要從事啤酒風味研究。E-mail：feiyunzh@jiangnan.edu.cn

*通信作者：李崎(1971—)，女，教授，博士，主要從事啤酒釀造和風味研究。E-mail：liqi@jiangnan.edu.cn