降膽固醇活性發酵乳桿菌F1發酵酸乳制備條件的研究

楊 瑤，曾小群，潘道東,2,*

(1.南京師范大學 國家乳品加工技術研發分中心，江蘇 南京 210097；2.寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江 寧波 315211)

降膽固醇活性發酵乳桿菌F1發酵酸乳制備條件的研究

楊 瑤1，曾小群1，潘道東1,2,*

(1.南京師范大學 國家乳品加工技術研發分中心，江蘇 南京 210097；2.寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江 寧波 315211)

以發酵乳桿菌F1發酵制備酸乳，以接種量、發酵時間和發酵溫度為考察因素，結合以感官評分為指標的響應面分析方法，確定發酵乳桿菌F1發酵酸乳的最佳發酵條件為：接種量4%、發酵時間8h、發酵溫度39℃。利用該條件發酵的酸乳，其膽固醇降解率達到49.16%，比優化前膽固醇的降解率提高了8.79%。

發酵乳桿菌；降膽固醇；響應曲面法

膽固醇是人體內重要的固醇類物質，但圍繞膽固醇與人體健康關系在世界范圍內食品學界和食品工業界一直存在很大爭議[1]。自21世紀30年代有國外學者研究得出“血管壁增厚即動脈粥樣硬化癥是不正常膽固醇代謝的結果”這一結論以來，已有越來越多的實驗和研究表明：膽固醇與動脈粥樣硬化、冠心病、腦中風等心腦血管疾病存在密切關系[2]。美國和國內營養和醫學專家推薦食物膽固醇的攝入量標準為不超過250～300mg/(d·人)，但隨著人民生活水平的提高和膳食營養的增加，膽固醇的攝入量很容易超標。因此，研究不限飲食、不影響食品風味、經濟實用的降低食品及人體血清膽固醇水平的方法已成為當前的研究熱點[3]。

乳酸菌大量存在于酸乳及其他相關發酵乳制品中。20世紀70年代，科學家先后通過對飲用酸乳等發酵乳制品的非洲Massai人和新生兒血清膽固醇的研究，以及對常飲酸乳美國人健康狀況調查，均發現乳酸菌具有降低人體血清膽固醇的作用[4-7]。因此，開發具有降膽固醇作用的乳酸菌及發酵乳制品的研究將具有十分重要的社會意義和應用價值。

通過前期實驗研究，本實驗室已篩選出一株具有較

高降膽固醇活性的乳酸菌——發酵乳桿菌Lactobacillus fermentum F1[8]。在此基礎上，本實驗將對發酵乳桿菌F1發酵制備酸乳過程中的接種量、發酵時間及發酵溫度3個因素進行研究，優化發酵乳桿菌F1發酵酸乳的最佳發酵條件，為功能性降膽固醇發酵乳制品的開發應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

發酵乳桿菌Lactobacillus fermentum F1為本實驗室篩選并保藏菌株[8]。

1.2 培養基

MRS培養基[9]：葡萄糖20g、酵母浸膏5g、牛肉浸膏5g、蛋白胨10g、乙酸鈉5g、檸檬酸三銨2.0g、K2HPO4·2H2O 2.0g、吐溫-80 1m L、MnSO4·H2O 0.25g、MgSO4·7H2O 0.6g、瓊脂15g、H2O 1000mL；高膽固醇培養基(MRS- CHOL)[10]：膽固醇0.1g、牛膽鹽0.2g、吐溫-80 1mL、冰乙酸5mL配成膽固醇母液，加熱溶解后加至1000mL MRS 液體培養基中，超聲波細胞粉碎機500W振蕩乳化20min，調pH 值至7.0，配成終質量濃度為100μg/mL的MRS- CHOL。以上培養基均在121℃條件下滅菌20min。

1.3 發酵劑配方與試劑

10g/100mL的脫脂奶粉，5g/100mL的綿白糖，95℃殺菌15min。

膽固醇、鄰苯二甲醛、冰醋酸、濃硫酸等均為國產分析純。

1.4 儀器與設備

Spectrum Lab 54 紫外-可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；MCFD 5005A 冷凍干燥機 上海安亭科學儀器廠。

1.5 方法

1.5.1 菌種活化

將保藏于－80℃冰箱中的菌種，在MRS平板上劃線分離單菌落，單菌落挑取至MRS液體培養基中，37℃培養至渾濁，轉接3次進行菌種活化。

1.5.2 發酵劑的制備

將活化的菌種由MRS液體培養基中按體積分數5%的接種量轉接到95℃殺菌15min的復原乳中，37℃發酵至凝乳，連續轉接兩次制成發酵劑。

1.5.3 發酵乳中膽固醇降解率的測定

1.5.3.1 膽固醇含量測定

采用OPA 法(o-phthaladehyde，鄰苯二甲醛法)[11]。

1.5.3.2 體外降膽固醇實驗

發酵劑5mL接種至100mL含100μg/mL 膽固醇和0.3g/100mL膽鹽的高膽固醇培養基(MRS- CHOL)中，37℃靜置培養24h，6000r/min 離心5min，上清液冷凍干燥后用于測定膽固醇含量。以未接種的高膽固醇培養基(MRS- CHOL)作對照。

1.5.4 感官評定

將不同樣品分別裝入紙杯中，選定10名感官評定人員進行感官評價，按照統一標準分別逐項對樣品進行打分匯總，以平均分制填評分表。發酵條件優化評價指標為：凝乳狀態10分、風味(氣味和滋味)10分、組織狀態(質構與流變)10分[12]。

1.5.5 響應面分析法優化酸乳發酵條件

根據單因素試驗結果，以接種量(x1)、發酵時間(x2)和發酵溫度(x3)3個因素與感官評分進行響應面試驗設計(表1)，優化發酵乳制備條件。通過Design Expert6.0軟件對試驗數據進行回歸分析，預測發酵乳的最佳發酵條件。

表1 發酵乳制備條件優化試驗因素水平及編碼Table 1 Factors and levels in central composite design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 接種量對發酵乳桿菌F1發酵乳品質的影響

添加5%綿白糖的滅菌復原乳接入體積分數為2%、3%、4%、5%的發酵乳桿菌F1，37℃發酵10h后，測定酸度，并進行感官評定，結果見表2。

表2 接種量對發酵乳桿菌F1發酵酸乳品質的影響Table 2 Effect of inoculum amount onL. fermentF1-fermented yogurt quality

表2顯示，接種量對酸乳品質影響較大，接種量偏低會導致產酸偏低、凝乳不好、香味淡、偏甜；接

種量偏高時雖然凝乳狀態好，但酸度過高導致樣品偏酸。綜合凝乳狀態、風味、組織狀態3方面因素, 接種量為4%較為適宜。

2.1.2 發酵時間對發酵乳桿菌F1發酵乳品質的影響

添加5%綿白糖的滅菌牛奶接入體積分數為4%的發酵乳桿菌F1，37℃條件下分別發酵6、8、10、12h后，測定酸度，并進行感官評價，結果見表3。

表3 發酵時間對發酵乳桿菌F1發酵酸乳品質的影響Table 3 Effect of fermentation time onL. fermentF1-fermented yogurt quality

表3顯示，發酵時間影響發酵程度。綜合凝乳狀態、風味、組織狀態3方面因素，發酵時間8 h較為適宜。

2.1.3 發酵溫度對發酵乳桿菌F1發酵乳品質的影響

添加5%綿白糖的滅菌牛奶接入體積分數為4%的發酵乳桿菌F1，分別于35、37、39、42℃發酵8h后，測定酸度，并進行感官評價，結果見表4。

表4 發酵溫度對發酵乳桿菌F1發酵酸乳品質的影響Table 4 Effect of fermentation temperature onL. fermentF1-fermented yogurt quality

如表4所示，發酵溫度對酸乳質量影響較大，溫度過高或過低都會影響發酵乳桿菌F1的生長，從而影響產品酸度、凝乳狀態、風味和組織。綜合感官評價，發酵乳桿菌F1在4%接種量發酵8h時，發酵溫度為39℃時產品質量較好。

2.2 發酵乳桿菌F1發酵酸乳最佳條件的響應曲面分析接種量、發酵時間、發酵溫度3個因素對發酵乳桿菌F1發酵酸乳具有交互影響作用，這種有交互影響的因素單憑單因素試驗無法確定他們的影響程度，難以找到最佳組合發酵條件。本實驗選擇Box-Behnken設計試驗，擬通過Design Expert 6.0軟件分析來確定最優發酵條件。以接種量、發酵時間、發酵溫度為自變量，發酵乳桿菌F1發酵酸乳的感官評分值為響應值，試驗設計與結果見表5。利用Design Expert 6.0軟件對表5數據進行二次多元回歸擬合，得到發酵酸乳感官得分預測值對編碼自變量X1、X2和X3的二次多項回歸方程：

Y=18.34－0.075X1+0.063X2+0.14X3－1.53X12－0.41X22－1.06X32+0.2X1X2－0.1X1X3+0.025X2X3

表5 發酵乳制備條件優化試驗設計與結果表Table 5 Central composite design matrix and predicted and experimental values of sensory score ofL. fermentF1-fermented yogurt

表6 回歸模型方差分析表Table 6 Analysis of variance for fitted regression equation

表7 回歸方程系數顯著性檢驗表Table 7 Significance test for each regression coefficient of fitted regression equation

對上述回歸模型進行方差分析，表6結果表明，模型是極顯著的(P＜ 0.0 1)，回歸模型的決定系數為0.8989，說明該模型能夠解釋89.89%的變化，因此，可用此模型對發酵乳制備條件優化效果進行分析和預測。

從表7可知：模型一次項X1、X2、X3均不顯著；二次項X12與X32極顯著，X22不顯著；交互項X1X2、X1X3、X2X3均不顯著。

利用Design Expert6.0軟件對表5數據進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應面分析圖及其等高線見圖1～3。等高線的形狀可以反映出因素間交互效應的強弱，圓形表示兩因素間交互作用不顯著，而橢圓形則顯著。

當發酵溫度為39℃時，接種量和發酵時間對發酵乳品質的影響見圖1。

圖1 接種量和發酵時間對發酵乳感官分析得分值影響的響應曲面和等高線Fig.1 Response surface and contour plots showing the interactive effects of inoculum amount and fermentation time on sensory score ofL. fermentF1-fermented yogurt

由圖1可知，發酵時間在7～9h范圍內，隨著發酵時間增加，發酵乳感官得分值先增加，當發酵時間達到一定值后，呈逐漸下降的趨勢。當發酵時間恒定，接種量在3.5%～4.5%范圍內，發酵乳感官得分值先逐漸增加，達到極大值，隨后逐漸下降。

當接種量為4%時，發酵時間和發酵溫度對發酵乳品質的影響見圖2。

從圖2可以看出，發酵溫度在38～40℃內，隨著發酵溫度升高，發酵乳感官得分值不斷增加，當發酵溫度達到一定值后，發酵乳感官得分值呈下降趨勢。發酵時間在7～9h內，隨著發酵時間的增加，發酵乳感官得分值也逐漸增加，當發酵時間達到一定值后，繼續增加發酵時間反而會影響發酵乳的感官品質。

圖2 發酵時間和發酵溫度對發酵乳感官分析得分值影響的響應曲面和等高線Fig.2 Response surface and contour plots showing the interactive effects of fermentation time and fermentation temperature on sensory score ofL. fermentF1-fermented yogurt

圖3 接種量和發酵溫度對發酵乳感官分析得分值影響的響應曲面和等高線Fig.3 Response surface and contour plots showing the interactive effects of inoculum amount and fermentation temperature on sensory score ofL. fermentF1-fermented yogurt

從圖3可以看出，發酵溫度在38～40℃內，隨著發酵溫度增加，發酵乳感官得分值先不斷增加，當發酵溫度達到一定值后，發酵乳感官得分值逐漸減小。接種量在3.5%～4.5%范圍內，發酵乳感官得分值先逐漸增加，達到極大值，隨后逐漸下降。

為了進一步確證最佳點的取值，對回歸方程取一階偏導等于零并整理得：

方程求解得到：X1=－0.022，X2=－0.091，X3= 0.066；根據表1計算，確定發酵乳桿菌F1的最佳發酵條件為：接種量3.978%，發酵時間7.909h，發酵溫度39.066℃。從實際操作考慮，實驗確定最終發酵條件為：接種量4%，發酵時間8h，發酵溫度39℃。為了進一步驗證發酵乳桿菌F1最優的發酵條件，采用上述條件即接種量4%，發酵時間8h，發酵溫度39℃進行3次重復實驗，結果發酵乳桿菌F1發酵酸乳感官評分值均達到了18.34，優化效果顯著。

2.3 發酵乳桿菌F1酸乳最佳發酵條件下膽固醇降解率的測定

采用響應面分析所獲得的最佳發酵條件即接種量4%，發酵時間8h，發酵溫度39℃，發酵制備發酵乳桿菌F1發酵酸乳。采用1.2.3節方法進行發酵乳中膽固醇降解率的測定，以本研究前期未優化的發酵乳發酵條件(接種量5%，發酵時間10h，發酵溫度37℃)為對照，結果發現優化前發酵乳桿菌F1發酵酸乳膽固醇的降解率為40.37%，優化后發酵乳桿菌F1發酵酸乳膽固醇的降解率為49.16%，膽固醇的降解率提高了8.79%。

3 結 論

接種量、發酵時間、發酵溫度對酸乳的品質影響很大，通過單因素分析和響應面分析最終確定發酵乳桿菌F1發酵酸乳的最佳發酵條件為：接種量4%、發酵時間8h、發酵溫度39℃。體外膽固醇含量測定表明，最佳發酵條件下，發酵乳桿菌F1發酵酸乳膽固醇降解率為49.16%，比優化前提高了8.79%，為降膽固醇功能酸乳開發提供了參考。但是，本實驗制備酸乳感官評分不高，原因可能是單菌發酵制備酸乳，菌株產酸能力較弱，在后續實驗中可考慮采用混菌發酵工藝。

此外，雖然發酵乳桿菌F1發酵酸乳具有優良的降膽固醇活性，將其開發成功能性乳制品有很好的應用前景，但若要進一步確證其降膽固醇功能性，還需要進行動物模型等體外實驗的驗證。

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Lactobacillus ferment F1 Fermentation of Yogurt with Cholesterol-degrading Activity

YANG Yao1，ZENG Xiao-qun1，PAN Dao-dong1,2,*
(1. Branch Center of National Dairy Products Processing Technology Development, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. College of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Cardiovascular disease is now becoming one of the most dangerous diseases. Currently, the development of functional foods to prevent cardiovascular diseases is the hot topic in food science. The probiotic Lactobacillia with cholesterol-degrading activity screened from Chinese traditional fermented foods can be applied to develop functional foods, which will be good for cardiovascular diseases. Lactobacillus ferment F1 was screened to reveal high cholesterol-degrading activity. The effects of inoculum amount, fermentation time and fermentation temperature were investigated to evaluate yogurt quality. The fermentation condition was optimized through response surface analysis (RSA) and the optimal fermentation condition was 4.0% inoculum amount and fermentation at 39 ℃ for 8 h. Under this optimal condition, the degradation rate of cholesterol reached up to 49.16%, and increased by 8.79% than before optimization.

Lactobacillus fermentum F1；cholesterol-degrading activity；response surface method (RSM)

TS201.3

A

1002-6630(2010)09-0126-05

2009-07-10

國家“863”計劃項目(2007AA10Z357)；“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD27B09)；江蘇省高校自然科學基金項目(09KJB550003)

楊瑤(1981—)，女，講師，博士，研究方向為食品微生物學。E-mail：45220@njnu.edu.cn

*通信作者：潘道東(1964—)，男，教授，博士，研究方向為乳品科學。E-mail：daodongpan@163.com