植物乳桿菌C21胞外多糖的分離純化及其結構修飾

李盛鈺，曾憲鵬，趙玉娟，張 雪，張 健，楊貞耐*

(吉林省農業科學院農產品加工研究中心，吉林 長春 130033)

植物乳桿菌C21胞外多糖的分離純化及其結構修飾

李盛鈺，曾憲鵬，趙玉娟，張 雪，張 健，楊貞耐*

(吉林省農業科學院農產品加工研究中心，吉林 長春 130033)

為研究乳酸菌胞外多糖的結構和性質，采用乙醇沉淀、DEAE-纖維素離子交換柱層析和 Sepharose CL-6B凝膠過濾層析方法從植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) C21 SDM液體培養基中分離純化得到一種均一組分的胞外多糖，命名為PCPc。采用離子色譜和紅外光譜法對其單糖組成和結構進行初步分析，結果表明，PCPc主要由半乳糖和葡萄糖兩種單糖組成，其物質的量比為1∶2。并對PCPc多糖進行化學修飾，獲得了其硫酸化和磷酸化衍生物。

乳酸菌；植物乳桿菌；胞外多糖

乳酸菌(lactic ac id ba cteria，LAB)胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到周圍培養基的黏液多糖(slime po lysaccharides，S P S)和連接在菌體表面的莢膜多糖(c a p s u l a r polysaccharides，CPS)的總稱[1]。乳酸菌胞外多糖可賦予發酵乳制品特殊的質構和風味，是一類公認食用安全(GRAS)的食品添加劑，可以作為增稠劑、穩定劑、乳化劑和膠凝劑等應用于各種食品中[2-4]。另外，研究表明，乳酸菌胞外多糖對人體健康也有促進作用，具有增強人體免疫力[5]、降低膽固醇[6]、抗腫瘤[7-8]、抗潰瘍[9]和改善腸道微生態環境[10]等生物活性，在醫藥領域具有廣闊的應用前景。

乳酸菌胞外多糖是一種長鏈，高分子質量聚合物，

由成百上千個相同的寡糖重復單元聚合而成，其化學組成和結構復雜多樣。乳酸菌胞外多糖的結構與其生理功能和生物活性的關系十分密切，多糖的分子質量、取代基的種類和數目、構象和單糖組成等都直接影響多糖的生物功能。為了更好的理解胞外多糖結構與其生物功能的關系，本研究從內蒙古傳統乳制品中分離出1株產胞外多糖乳酸菌，經API 50 CHL和16S rRNA鑒定為植物乳桿菌，對其產胞外多糖進行分離純化和單糖組成分析。采用化學方法修飾其胞外多糖，獲得硫酸化和磷酸化衍生物。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

植物乳桿菌(L. plantarum)C21分離自內蒙古奶豆腐。菌株經API 50 CHL培養基(法國Bio-Merieux公司)和16S rRNA鑒定為植物乳桿菌[11]，本實驗室保存。菌株接種于SDM液體培養基中[12]，37℃培養20h，用于胞外多糖提取。

DEAE-纖維素 上海恒信化學試劑有限公司；Sepharose CL-6B(Phamacia公司)；標準單糖 加拿大Bio Basic Inc.公司；Dextran 標準葡聚糖 法國Fluka公司；其余試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

ICS2500離子色譜儀 美國Dionex 公司；Thermo Nicolet 380紅外光譜儀 美國 Thermo公司；722可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3 胞外多糖的分離純化

植物乳桿菌C21胞外多糖的提取按Cerning等[13]的方法進行，粗多糖經DEAE-纖維素離子交換柱層析(2.6cm× 30cm)進一步純化。稱取多糖樣品100mg，加入5mL水使其溶解，上到平衡后的DEAE-纖維素柱上。依次以蒸餾水、0.2mol/L、0.5mol/L NaCl溶液洗脫。流速為1mL/min，部分收集器收集洗脫液，每管5mL，苯酚-硫酸法檢測多糖含量，按照吸收峰收集各部分樣品，透析，凍干。取水洗脫部分經SepharoseCL-6B柱色譜進一步純化。以0.9g/100mL NaCl溶液洗脫，流速為0.4mL/min，每20min收集一管，BS-100A自動收集器，苯酚-硫酸法測糖分布。洗脫液經透析后凍干。

1.4 單糖組成分析

取1mg PCPc多糖，加入2mol/L的三氟乙酸(TFA) 0.5mL，密封，于110℃水解4h，旋轉蒸發至pH值中性，凍干。等量的標準單糖(阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和果糖)混合后配制成66nmol/L溶液。胞外多糖水解樣和標準單糖水溶液分別以陰離子交換色譜柱分離。色譜條件：電化學檢測器E D 4 0，ICS3000 GP 50四元梯度泵，AS40自動進樣器，Chromeleon 6.8工作站。采用CarboPac PA10(4mm× 250mm) 陰離子交換色譜柱分離，以18mmol/L NaOH溶液和電阻率18.2MΩ·cm的超純水為洗脫液作梯度洗脫，流速為1mL/min。進樣量：25μL，柱溫：30℃，檢測器：脈沖安培檢測器(PAD)。

1.5 胞外多糖的結構修飾[14]

將附有冷凝裝置的三頸瓶中加入10mL吡啶，冰浴10min后，緩慢滴加氯磺酸1mL，三頸瓶內出現淡黃色固體，60℃水浴加熱使其溶解。取出1mL加入到20mg PCPc多糖樣品中，充分溶解樣品后，60℃水浴反應2h。反應結束后，加入30g/100mL NaOH溶液中和，加10mL無水乙醇沉淀多糖，10000r/min離心10min，沉淀透析，凍干。取2mg KBr壓片，紅外光譜檢測。

POCl3(1mL)加入到9mL吡啶中，冰浴下磁力攪拌15min。PCPc多糖樣品20mg加1mL吡啶溶解后，加入POCl3的吡啶溶液0.5mL，室溫下磁力攪拌反應1h。反應結束后，加入0.2mL 30g/100mL NaOH溶液中和。加5mL丙酮沉淀多糖，10000r/min離心10min，沉淀透析，凍干。取2mg KBr壓片，紅外光譜檢測。

2 結果與分析

2.1 胞外多糖的分離純化

植物乳桿菌(L.plantarum)C21按體積分數3%接種量接種于1000mL SDM液體培養基中，37℃培養20h后，經離心、TCA脫蛋白、乙醇沉淀、透析和凍干等步驟分離得到粗胞外多糖110mg，命名為PCPa[13]。苯酚-硫酸法檢測PCPa多糖含量達51.2%。PCPa經DEAE-纖維素離子交換柱層析，以蒸餾水洗脫，洗脫液透析、凍干后得多糖66mg，命名為PCPb(圖1)。上述結果說明C21胞外多糖為中性多糖。PCPb上Sepharose CL-6B分子篩層析柱進一步純化，洗脫峰為單一對稱峰(圖2)，說明該多糖為分子量均一的組分。洗脫液透析、凍干得純化多糖PCPc 47mg。PCPc為白色纖維狀疏松固體，溶于水，易形成無色透明的膠體，不溶于丙酮、乙醇等有機溶劑。

圖1 PCPa DEAE-纖維素離子交換柱層析Fig.1 DEAE-cellulose ion exchange column chromatography of PCPa

圖2 PCPb Sepharose CL-6B分子篩層析柱層析Fig.2 Gel filtration chromatography of PCPb on Sepharose CL-6B column

2.2 胞外多糖的結構分析

通過多糖水解產物離子色譜分析結果與標準單糖樣品保留時間的對比，確定PCPc單糖種類為半乳糖和葡萄糖(圖3)。根據峰面積比計算物質的量比，結果測得PCPc的單糖組分中半乳糖和葡萄糖的物質的量比為1∶2。

圖4 PCPc(A)及其硫酸化(B)和磷酸化(C)衍生物的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of PCPc, its sulfated and phosphorylated derivatives

圖3 標準單糖(A)及PCPc水解樣品(B)的高效陰離子色譜圖Fig.3 Ion exchange chromatography analysis of standard monosaccharides and hydrolyzed products of PCPc

PCPc的紅外譜圖見圖4A。3600～3200cm-1出現的寬峰為糖類物質中分子內和分子間氫鍵的O－H伸縮振動；2925cm-1附近一小尖峰為C－H伸縮振動；在1644cm-1左右有多糖的水合振動峰；以及1041cm-1處有多糖的特征吸收峰；證明PCPc的主要成分是多糖。1250～950cm-1間比較大的吸收峰是由兩種C－O的伸縮振動引起的，一種是屬于C－O－H的，另一種是吡喃糖環的C－O－C；而在890cm-1附近無吸收峰，提示PCPc多糖分子結構中存在α型糖苷鍵。

2.3 胞外多糖的結構修飾

圖4B是PCPc硫酸化衍生物的紅外光譜圖，與圖4A比較，圖譜中都出現了1228cm-1左右的S==O伸縮振動和836cm-1左右的C－O－S伸縮振動的特征吸收峰，說明硫酸根已經與PCPc分子結合成酯。硫酸化PCPc圖譜中多糖的特征峰依然存在，說明本方法不會對多糖的結構造成破壞，是一種較為溫和的硫酸化方法。但由于受到硫酸根的影響，其他基團的特征峰都稍微偏離了原來的位置。

磷酸酯化后的PCPc多糖(圖4C)在吸收峰波形、波數、吸收峰強度、峰寬等指標上十分接近PCPc，說明兩者的成分非常相似，磷酸酯化反應后并沒有雜質生成。磷酸酯化PCPc多糖的紅外光譜顯示了兩個特征吸收帶，一個是在1270cm-1的是由于不對稱P＝O伸縮振動引起的，另外在882cm-1和703cm-1附近的特征吸收帶是由對稱的C－O－P 拉伸振動引起的。證明了磷酸基已被酯化到PCPc多糖上去。

3 討 論

乳酸菌作為一類食品級微生物，所產胞外多糖是安全無毒的，且胞外多糖具有獨特的生理功能和良好的流變學特性，對發酵乳品生產至關重要，廣泛應用于酸奶、干酪和乳酸飲料等的生產。而對胞外多糖分離純化和結構研究，了解化學結構與生物功能的關系是其應用的基礎。因此，本研究對1株自主分離和鑒定的植物乳桿菌所產胞外多糖進行了分離和純化，獲得高純度胞外多糖，初步分析了其結構，為對其進一步的功能特性研究和構效關系研究提供了參考。后續研究將采用化學分析(如甲基化分析)和波譜分析(如NMR)等方法進一步分析和確定C21胞外多糖重復單元的結構。

乳酸菌胞外多糖在食品、醫藥和化工領域的應用潛力日益受到關注。作為一種天然高分子聚合物，乳酸菌胞外多糖在應用中往往受到限制。通過對胞外多糖進行分子結構修飾，可以改善其理化特性，獲得新的功能特性和生物活性，并擴展其應用領域。本研究采用化學方法對植物乳桿菌C21胞外多糖進行了結構修飾，

獲得了硫酸化和磷酸化衍生物。后續研究將通過比較修飾前后胞外多糖在流變學性質和生物功能等方面的變化，進一步探討胞外多糖的構效關系。

[1]de VUYST L, DEGEEST B. Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria[J]. FEMS Microbiol Rev, 1999, 23(2)∶ 153-177.

[2]BOUZAR F, CERNING J, DESMAZEAUD M. Exopolysaccharide production and texture-promoting abilities of mixed-strain starter cultures in yogurt production[J]. J Dairy Sci, 1997, 80(10)∶ 2310-2317.

[3]CERNING J, MARSHALL V M E. Exopolysaccharides produced by the dairy lactic acid bacteria[J]. Recent Res Dev Microbiol, 1999, 3(2)∶195-209.

[4]CRESCENZI V. Microbial polysaccharides of applied interest∶ on going research activities in Europe[J]. Biotechnol Progr, 1995, 11(3)∶ 251-259.

[5]HOSONO A, LEE J, AMETANI A, et al. Characterization of a water soluble polysaccharide fraction with immunopotentiating activity from Bifidobacterium adolescentis M101-4[J]. Biosci Biotech Biochem, 1997, 61(2)∶ 312-316.

[6]NAKAJIMA H, SUZUKI Y, KAIZU H, et al. Cholesterol lowering activity of ropy fermented milk[J]. J Food Sci, 1991, 57(6)∶ 1327-1329. [7]KITAZAWA H, HARATA T, UEMURA J, et al. Phosphate group requirement for mitogenic activation of lymphocytes by an extracellular phosphopolysaccharide from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus [J]. Int J Food Microbiol, 1998, 40(3)∶ 169-175.

[8]NAKAJIMA H, TOBA T, TOYODA S. Enhancement of antigen-specific antibody production by extracellular slime products from slimeforming Lactococcus lactis subspecies cremoris SBT 0495 in mice[J]. Int J Food Microbiol, 1995, 25(2)∶ 153-158.

[9]NAGAOKA M, HASHIMOTO S, WATANABE T, et al. Anti-ulcer effects of lactic acid bacteria and their cell wall polysaccharides[J]. Bio Pharm Bull, 1994, 17(8)∶ 1012-1017.

[10]BLUM S, RENIERO R, SCHIFFRIN E J, et al. Adhesion studies for probiotics∶ need for validation and refinement[J]. Trends Food Sci Technol, 1999, 10(12)∶ 405-410.

[11]趙玉娟, 牛春華, 張雪, 等. 16S rRNA序列分析及其在乳酸菌分類、鑒定中的應用[J]. 食品科學, 2009, 30(7)∶ 299-303.

[12]KIMMEL S A, ROBERT R F. Development of a growth medium suitable for exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus RR[J]. Int J Food Microbiol, 1998, 40(1/2)∶ 87-92.

[13]CERNING J, RENARD C M G C, THIBAULT J F, et al. Carbon source requirements for exopolysaccharide production by Lactobacillus casei CG11 and partial structure analysis of the polymer[J]. Appl Environ Microbiol, 1994, 60(11)∶ 3914-3919.

[14]YUAN Huamao, ZHANG Weiwei, LI Xuegang, et al. Preparation and in vitro antioxidant activity of k-carrageenan oligosaccharide and their oversulfated, acetylated, and phosphorylated derivatives[J]. Carbohydr Res, 2005, 340(4)∶ 685-692.

Isolation, Purification and Structural Modification of Exopolysaccharide from Lactobacillus plantarum C21

LI Sheng-yu，ZENG Xian-peng，ZHAO Yu-juan，ZHANG Xue，ZHANG Jian，YANG Zhen-nai*
(Center of Agro-Food Technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China)

In order to investigate the structure and properties of exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum C21, a neutral exopolysaccharide was isolated from culture supernatant and purified by ethanol precipitation, DEAE-cellulose ion exchange column chromatography and gel filtration chromatography on Sepharose CL-6B column. The structure of this exopolysaccharide was determined by ion chromatography and FTIR spectroscopy and this exopolysaccharide was designated as PCPc. Results indicated that the PCPc was composed of D-galactose and D-glucose in a molar ratio of 1∶2. Sulfated and phosphorylated derivatives of PCPc were also prepared.

lactic acid bacteria；Lactobacillus plantarum；exopolysaccharide

Q939.9

A

1002-6630(2010)09-0131-04

2009-08-10

國家自然科學基金項目(30670057)

李盛鈺(1977—)，男，副研究員，博士，主要從事食品生物技術研究。E-mail：lisy720@126.com

*通信作者：楊貞耐(1965—)，男，研究員，博士，主要從事乳品工藝與生物技術研究。E-mail：zyang@cjaas.com