乳清蛋白酶解物促嗜酸乳桿菌增殖作用研究

白鳳翎，李曉東，廖 玲，張柏林,*，金 蘇，汪 濤，蔣湘寧

(1.北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083；2.渤海大學生物與食品科學學院，遼寧 錦州 121000)

乳清蛋白酶解物促嗜酸乳桿菌增殖作用研究

白鳳翎1,2，李曉東1，廖 玲1，張柏林1,*，金 蘇1，汪 濤1，蔣湘寧1

(1.北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083；2.渤海大學生物與食品科學學院，遼寧 錦州 121000)

利用胃蛋白酶水解乳清蛋白，獲得酶解產物的優化工藝條件是pH值為2.2，水解溫度為65℃，底物質量濃度為2g/100mL，酶與底物比為7%，其蛋白水解度為12.51%。乳清蛋白水解物與經過超濾和凝膠過濾后的分離物對嗜酸乳桿菌B有較好的增殖作用，其中分子量1000D以下的酶解產物增殖效果最為顯著。質譜分析證實該段水解產物是分子量集中在213.2～956.9D之間的寡肽和氨基酸復合物，可使嗜酸乳桿菌B活細胞數量提高一個對數級。顯然，應用廉價乳清蛋白水解產物作為培養基質可以提高嗜酸乳桿菌B的細胞數量。

乳清蛋白酶解物；嗜酸乳桿菌B；增殖

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)主要來源于宿主(人和動物)的腸道系統。當外源口服足夠數量時，嗜酸乳桿菌具有緩解乳糖不耐受癥、調整腸道系統內有益和有害微生物菌群的平衡、改善機體免疫能力、降低血清膽固醇及抑制腫瘤形成等多種生理功能，是我國衛生部列出的9類益生菌之一[1]。按國際和國內規定要求，益生菌在貨架期內的活菌數目不得少于106CFU/mL 或106CFU/g，否則不能產生渴望的健康訴求[1-2]。然而，由于自身生長特性及環境因素的影響，流通進入市場的益生菌產品中的活菌數量很低，往往無法滿足其產品的質量要求，因此提高嗜酸乳桿菌的活菌含量則成為大規模益生菌制劑生產中的一項重要研究內容[3]。通常，包括嗜酸乳桿菌在內的乳酸菌大規模培養時，有必要添加一些富含維生素和氨基酸等生長因子的物質對其進行增殖，以便在細胞高密度培養時獲得大量的活細胞。其中，氨基酸除了滿足乳酸菌生長之外，對乳酸菌的生長還具有刺激作用[4]。國內外的部分研究證明，添加乳清蛋白和酪蛋白水解物對乳酸菌具有增殖效果[5-6]。添加乳清蛋白、酪蛋白及胱氨酸等到乳酸菌培養介質中可明顯改善乳酸菌的生長，加入還原劑不僅提高了某些乳酸菌的耐氧效果，而且可以使酸奶中嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌的存活期限顯著延長[7-9]。

本實驗旨在以蛋白含量34.7%的乳清蛋白作為底物，用胃蛋白酶對其進行酶解，確定酶解乳清蛋白的優化工藝條件，再對其酶解產物進行分級過濾后，研究不同分子量范圍的乳清蛋白水解產物(whey pro tein hydrolysate，WPH)對嗜酸乳桿菌的增殖效果，為提高益生菌的活菌數量探索一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及培養條件

嗜酸乳桿菌B(Lactobacillus acidophilus B)由波蘭羅茲技術大學發酵工程與工業微生物系工業微生物菌種收藏中心(Lock 105)提供。冷凍干燥的供試菌株首先按體積分數10%的接種量被轉接到MRS液體培養基中，37℃厭氧培養24h。每次測試前，菌株B均在MRS液體培養基中活化兩次，37℃厭氧過夜培養，以便充分恢復活力。

1.1.2 培養基

MRS培養基(g/L)：蛋白胨10.0、葡萄糖20.0、牛肉膏 10.0、酵母膏 5.0、無水乙酸鈉5.0、檸檬酸二銨2.0、吐溫-80 1.0mL、硫酸鎂 0.58、硫酸錳 0.28、瓊脂15.0、pH6.2～6.4；改良乳酸菌增殖培養基(g/100mL)：葡萄糖 2.0、酵母膏0.25、西紅柿汁 10.0m L、鹽溶液甲(KH2PO4和K2HPO4各5g溶于50mL水中)和鹽溶液乙(0.1g NaCl、0.1g FeSO4和 0.1g MgSO4溶于50mL水中)各5.0mL，吐溫-80 1.0mL。

1.1.3 試劑

乳清濃縮蛋白(whey protein concentrate，WPC，蛋白含量為34.7%，乳糖含量為58.6%) 河北天香乳業有限公司；茚三酮 北京化學試劑廠；牛血清白蛋白北京鼎國生物科技有限公司；酪氨酸標準物、胃蛋白酶P-700、低分子量標準蛋白 美國Sigma 公司；丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、S D S、葡聚糖凝膠SephadexG-25、G-15 北京欣經科生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳清蛋白水解工藝

以34.7%乳清蛋白為底物，選用胃蛋白酶在前期單因素試驗基礎上，參照文獻[10]進行蛋白水解正交試驗，水解后95℃滅酶5min，5000r/min離心5min取上清液，按文獻[11]測定WPH中氨基酸和多肽的含量，計算水解度(DH)。

DH /%=c×(1/1000m)×V1×(100/V2) ×100

式中：c為蛋白質質量濃度/(g/L)；m為WPC的質量/g；V1為水解液的總體積/mL；V2為顯色時所用稀釋液的總體積/mL。

1.2.2 乳清蛋白WPH的超濾分級

取乳清蛋白水解液100mL，用水稀釋至500mL，選用標準分子量為10、8、5kD的 Biomax系列濾膜進行三級超濾分級，將大于10kD、8～10kD、5～8kD和小于5kD 4個分子量范圍的水解產物分別收集，冷凍干燥后保存備用。

1.2.3 WPH的凝膠層析純化

將交聯葡聚糖凝膠Sephadex-G25用水溶脹后裝入1.6cm×60cm的分離柱中，用床體積2～3倍的0.05mol/L乙酸溶液洗脫平衡，選擇對嗜酸乳桿菌有顯著增殖效果的組分(小于5kD)經10000r/min離心，0.45μm的纖維素膜過濾后上柱，收集多肽組分。

1.2.4 WPH的SDS-PAGE電泳分析

取乳清蛋白及水解度為12.09%的不同質量濃度的WPH(4.0、2.0、1.0、0.5mg/mL)與不同水解時間(0、2、4、6 h)的W P H，濃縮膠為5%，分離膠為12.5%，按文獻[12]進行SDS-PAGE分析獲得蛋白電泳圖譜。

1.2.5 WPH對嗜酸乳桿菌B的增殖作用

將嗜酸乳桿菌B在MRS培養基進行活化后，以1.0%接種量接種于改良乳酸菌增殖培養基。在增殖實驗組中分別添加WPC、乳清蛋白酸水解物、WPH、經超濾分離的WPH各級組分(分子量大于10kD、10～8kD、8～5kD、小于5kD)以及以最優工藝條件不同酶解時間(6、4、2、0h)的WPH，添加量為0.015g/100mL，同時以乙酸銨(無機氮源)為對照組，使各組培養基的含氮量及pH值相等。每組分做4個平行實驗，37℃溫箱培養，每隔一定時間測定OD600nm和pH值，同時按文獻[13]以質量濃度0.15g/100mL蛋白胨溶液進行10倍系列稀釋后，選擇合適的稀釋度用MRS培養基進行嗜酸乳桿菌活菌計數。

1.2.6 WPH的質譜分析

在電噴霧離子化/質譜下(ESI/MS，Fragmentor∶70)，對嗜酸乳桿菌B具有增殖活性組分(＜5kD)應用API3000進行陽離子全面掃描。

1.2.7 統計分析

所有實驗數據重復測定3次，結果為平均值±標準差。實驗數據用Excel 2003進行單因素方差分析和顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 乳清蛋白水解工藝優化

從表1可以看出，影響胃蛋白酶水解乳清蛋白水解度的4個因素依次是酶與底物比、pH值、底物質量濃度和溫度，其中pH值和酶與底物比影響程度相近，優化工藝組合為A3B3C2D3。基于優化組合條件，乳清蛋白酶解4h后的水解度實測值為12.51%，略高于表1中最大水解度預測值12.09%。由此，可以確定胃蛋白酶酶解乳清蛋白的最佳條件為pH2.2、酶解溫度65℃、底物質量濃度2g/100mL、酶與底物比7%。

表1 胃蛋白酶酶解乳清蛋白正交試驗L9(34)設計與結果Table 1 Design and results of orthogonal test for whey protein hydrolysis

2.2 WPH超濾分級和電泳分析

WPH經超濾后分別獲得了大于10kD、8～10kD、5～8kD和小于5kD四級分離物，分別稱之為組分Ⅰ、組分Ⅱ、組分Ⅲ和組分Ⅳ。對WPH酶解產物和乳清蛋白不同質量濃度的SDS-PAGE電泳分析(圖1)可以看出，所有質量濃度下的乳清蛋白均呈現出清晰的蛋白泳帶，但對WPH來說，僅有質量濃度為4.0mg/mL的水解產物呈現略微清晰的泳帶(分子量接近于18.4kD)，因此選擇4.0mg/mL作為比較乳清蛋白酶解狀況的基準質量濃度。

圖1 不同樣品質量濃度下SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of whey protein hydrolysates with different concentrations

圖2 不同酶解時間的WPH的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE of whey protein hydrolysates obtained from different hydrolysis times

由圖2可以看出，當酶解2h后，乳清蛋白酶解產物僅呈現出一條清晰的分子量接近18.4kD的蛋白帶，但4h以后酶解產物并不能呈現蛋白條帶，這意味著蛋白基本被酶解成小的片斷。因此，在優化工藝條件下酶解4h后，可以推測乳清蛋白基本上被水解為小分子多肽及氨基酸。

2.3 WPH的凝膠層析純化

圖3 WPH(＜5kD)Sephadex-G 25凝膠層析圖譜Fig.3 Chromatograph of whey protein hydrolysates separated by Sephadex-G 25

分子量小于5kD的WPH組分Ⅳ經Sephadex-G25凝膠過濾層析后得到3個峰(圖3)，進一步分別收集不同峰的組分，稱為組分Ⅳ-1、Ⅳ-2和Ⅳ-3并冷凍干燥后備用。經茚三酮法[10]對組分Ⅳ-1、Ⅳ-2和Ⅳ-3進行測定，結果表明組分Ⅳ-1和Ⅳ-2含有一定量的肽，而組分Ⅳ-3含量很少。因此，選擇組分Ⅳ-1和Ⅳ-2分別進行嗜酸乳桿菌B增殖實驗研究。

圖4 WPH組分Ⅳ-2 Sephadex-G 15凝膠層析圖譜Fig.4 Chromatograph of the fraction 2 from whey protein hydrolysates separated by Sephadex-G 15

圖4是WPH組分Ⅳ-2經Sephadex-G15柱過濾層析的結果，從組分Ⅳ-2可以得到兩個峰，收集后稱為組分Ⅳ-21和Ⅳ-22，分別對嗜酸乳桿菌B進行增殖實驗研究。

2.4 WPH對嗜酸乳桿菌B的增殖研究

2.4.1 WPH對嗜酸乳桿菌B的增殖作用

以WPH作為添加物，同時以乳清蛋白和乳清蛋白酸水解物作為參照物進行嗜酸乳桿菌B增殖實驗，結果見表2。

從表2的OD600nm值可以看出，在37℃培養12h后，與對照組(乙酸銨為碳源)相比，添加乳清蛋白或乳清蛋白酸水解物并沒有顯著改善嗜酸乳桿菌B的生長。然而，添加WPH后，嗜酸乳桿菌B培養12h的OD600nm值平均比對照組高0.119，差異顯著，說明在培養基中添加WPH會對嗜酸乳桿菌B具有顯著的增殖效果。

圖6 嗜酸乳桿菌B在不同組分WPH作用下對數生長末期介質的pH值Fig.6 Media pH ofL. acidophilusB at the log growth phase under the aid of different fractions separated from whey protein hydrolysates

表2 WPH對嗜酸乳桿菌B的增殖效果Table 2 Effect of whey protein hydrolysates on the proliferation ofL. acidophilusB

2.4.2 不同分子量范圍的WPH組分對嗜酸乳桿菌B的增殖作用

圖5 不同分子量范圍WPH對嗜酸乳桿菌B的增殖作用Fig.5 Effect of whey protein hydrolysates with various molecular weights on the proliferation ofL. acidophilusB

從圖5可以看出，與對照組相同，添加組分Ⅰ后嗜酸乳桿菌B的生長沒有太大變化；添加組分Ⅱ、組分Ⅲ和組分Ⅳ的OD600nm值較對照組有一定的增加，說明這3組成分對嗜酸乳桿菌B都有一定的生長促進作用，其中以組分Ⅳ的作用比較明顯。

在對數生長末期(8h)后，對各WPH組分增殖培養介質的pH值測定結果見圖6，顯然各個組分與對照組之間培養介質在pH值上呈現明顯差異，這從另一方面說明添加WPH組分后會加速嗜酸乳桿菌B的生長，從而引起介質的pH值快速下降。

2.4.3 WPH分離純化組分對嗜酸乳桿菌B的增殖作用

由表3可見，與對照組相比，所有來自組分Ⅳ的WPH水解物均能明顯促進嗜酸乳桿菌B的生長。同時，隨著組分IV中分離物(多肽和氨基酸)的進一步被純化，嗜酸乳桿菌B的OD600nm值逐漸增大，說明經過純化的組分中含有嗜酸乳桿菌B的增殖因子。

進一步的活菌計數表明，WPH組分Ⅳ和Ⅳ-21對嗜酸乳桿菌B的增殖效果比對照組提高一個數量級(圖7)，這說明經過胃蛋白酶酶解的WPH對嗜酸乳桿菌B具有顯著的增殖作用，且組分Ⅳ-21比組分Ⅳ增殖作用顯著提高，可能是經過純化后其中的WPH活性成分增多或增強的緣故。

圖7 WPH組分對嗜酸乳桿菌B的增殖作用Fig.7 Effect of different separation fractions of whey protein hydrolysates on the proliferation ofL. acidophilusB

表3 不同WPH分離組分對嗜酸乳桿菌B的增殖作用Table 3 Effects of different separation fractions from whey protein hydrolysates on the proliferation ofL. acidophilusB

2.5 WPH組分的質譜分析

對嗜酸乳桿菌B具有明顯增殖作用的WPH組分Ⅳ-21進行質譜分析表明(圖8，A圖為Ⅳ-21組分的m/z 100～1500的POSITIVE FULL SCAN，B圖為Ⅳ-21組分的m/z 200～600 POSITIVE FULL SCAN)，WPH Ⅳ-21組分的相

對分子質量信息分別為m/z 379.3、402.0、478.9或m/z 535.8，這意味著組分Ⅳ-21是一些分子量在213.2～956.9D之間的一些2肽至8肽的寡肽混合物，表明分子量低于1000D的肽類和氨基酸復合物能顯著促進嗜酸乳桿菌B的生長。

由于乳酸菌不能同化無機氮源，因此它們必須降解蛋白質和多肽來滿足對氨基酸的需要，乳酸菌在乳中生長依靠其蛋白水解體系，該體系包括降解酪蛋白形成多肽片段的酶、轉運寡肽進入細胞內的轉運酶和細胞內部降解多肽為氨基酸的酶[14]。乳酸乳球菌在乳中生長所依賴氮源的98%來自于乳中的寡肽，其中寡肽轉運系統發揮著非常關鍵的作用[15]，如此說明乳酸乳球菌生長中多肽的形成、轉運和降解具有非常重要的作用。雖然乳酸乳球菌胞外PI型蛋白酶水解β-酪蛋白就可產生100多種寡肽[16]，但乳酸菌開始水解蛋白的能力很有限，一些必需氨基酸如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的含量很低[14]，不能滿足細菌生長的需要。因此，若提高乳酸菌的生長繁殖速度，在培養基中添加多肽和氨基酸是一條有效途徑。同時乳清蛋白水解物對胞外多糖的形成和降低抗原性都具有很好作用[17-18]，從而提高了乳制品的品質。以上實驗結果表明在嗜酸乳桿菌B培養基中提供一些寡肽和氨基酸就能夠加快氮源利用，使細胞繁殖很快達到一個較高的水平。

圖8 組分Ⅳ-21質譜掃描全圖Fig.8 Mass spectra of fraction 21 separated from whey protein hydrolysates

3 結 論

相對于乳清蛋白而言，胃蛋白酶酶解的WPH組分

能促進嗜酸乳桿菌B的生長，且隨著WPH分離組分分子量的降低其增殖作用逐漸增強，分子量低于1000D的多肽和氨基酸復合物能更好的促進嗜酸乳桿菌B的生長。顯然，在大規模益生菌制劑生產中，應用廉價乳清蛋白酶解產物作為培養基質能夠提高益生菌的細胞數量。

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Effect of Pepsin-based Whey Protein Hydrolysates on Proliferation of Lactobacillus acidophilus

BAI Feng-ling1,2，LI Xiao-dong1，LIAO Ling1，ZHANG Bo-lin1,*，JIN Su1，WANG Tao1，JIANG Xiang-ning1
(1. College of Biological Science and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China；2. College of Biotechnology and Food Science, Bohai University, Jinzhou 121000, China )

The optimal hydrolysis condition to obtain whey protein hyrolysates was pH 2.2, temperature at 65 ℃, substrate concentration of 2 g/100mL, and ratio between enzyme and substrate of 7%. The degree of hydrolysis (DH) reached up to 12. 51% whey protein. Whey protein hydrolysates and the fragments purified by ultra filtration and gel filtration exhibited an excellent proliferation effect on Lactobacillus acidophilus B. The fragments with molecular mass ranged from 213.2 to 956.9 D could promote this probiotic strain to grow 10 times faster than the control. Therefore, the addition of pepsin-based whey protein hydrolysates in media may be an economic and helpful strategy to improve the proliferation of probiotics.

whey protein hydrolysate；Lactobacillus acidophilus B；proliferation

TS252.1

A

1002-6630(2010)09-0161-05

2009-07-03

國家“863”計劃項目(2008AA10Z335；2006AA10Z344)

白鳳翎(1964—)，男，教授，博士研究生，研究方向為食品微生物學與食品生物技術。E-mail：baifling@yahoo.com.cn

*通信作者：張柏林(1963—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：Zhangbolin888@126.com