膽固醇氧化酶高產菌株的篩選及鑒定

蔡 丹，張娜娜，劉景圣*

(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

膽固醇氧化酶高產菌株的篩選及鑒定

蔡 丹，張娜娜，劉景圣*

(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

將從不同地點采集到的9個樣品進行分離篩選，從中分離到23株以膽固醇為唯一碳源的菌株，確定其中1株胞外膽固醇氧化酶高產菌株A3，其膽固醇氧化酶的活力為525U/L。經過形態學和生理生化實驗初步鑒定，該菌株屬于短桿菌屬(Brevibacterium sp.)。

膽固醇氧化酶；菌株；篩選

膽固醇(cholesterol)又叫膽甾醇，是機體內重要的固醇類物質，具有多種多樣的生理功能，它是細胞膜的組成部分，與膜的通透性及神經傳導密切相關，它也是類固醇激素、VD、膽汁酸等的前體物質，同時參與機體免疫系統。所以，膽固醇是人類維持正常生理活動所必需的營養物質，具有重要的生理功能[1-2]。但是血清中膽固醇含量過高也會影響人類的健康，目前因膽固醇過高而引起的動脈粥樣硬化、冠心病、腦中風等心腦血管疾病已嚴重威脅人體健康。為了避免人體從飲食中攝取過多的膽固醇，采用合適的加工技術降低食品中的膽固醇含量是解決這一問題的有效途徑。采用生物學方法尤其是利用微生物產生的膽固醇氧化酶分解食品中的膽固醇成為一種比較經濟而有效的降低食品中膽固醇的方法[3-5]。膽固醇氧化酶(cholesterol ox idase，EC1.1.3.6，COD)作為膽固醇代謝途徑第一步反應的關鍵酶，能專一性地催化膽固醇生成膽甾-4-烯-3-酮和H2O2，在食品加工領域具有良好的應用價值[6-9]。

本實驗主要研究膽固醇氧化酶高產菌株的篩選及鑒定，以期豐富膽固醇氧化酶的菌種資源，為膽固醇氧化酶的工業化應用提供可靠的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

樣品：分別從雙陽油田、吉林金翼蛋品有限公司、吉林省阿滿食品有限公司等處采集土樣樣品，記錄好采集地點、時間及天氣條件等。

膽固醇標品、辣根過氧化物酶、Triton X-100 北京鼎國生物技術有限公司；4-氨基-安替比林 國藥集團化學試劑有限公司；疊氮鈉、苯酚、過氧化氫、異丙醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等均為國產分析純。

1.1.2 培養基

基礎培養基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸餾水1L，pH 7.5，121℃滅菌20min；選擇培養基：膽固醇2g、NH4NO30.2g、NaCl 1g、KH2PO41.6g、Triton X-100 3 mL、瓊脂 20 g、蒸餾水 1L，pH7.5，121℃滅菌20min；發酵培養基：膽固醇1g、葡萄糖 5g、

酵母粉 6g、CH3COONH42g、K2HPO40.2g、MgSO4· 7H2O 0.05g、NaCl 1g、FeSO4·7H2O 0.01g、 Triton X-100 3mL、蒸餾水1L， pH7.5，121℃滅菌20min；菌種鑒定培養基：1)葡萄糖發酵培養基：葡萄糖5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 3g、Na2HPO4·12H2O 2g、加入0.2%溴麝香草酚藍溶液使其體積分數為1.2%、蒸餾水1L，pH7.0，121℃滅菌20min；2)甲基紅實驗培養基：蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2HPO45g、蒸餾水1L，pH 7.0，121℃滅菌20min；3)檸檬酸鹽實驗培養基：檸檬酸鈉5g、NaCl 5g、MgSO4·7H2O 0.2g、(NH4)H2PO41g、K2HPO41g、瓊脂20g、蒸餾水1L，0.2%溴麝香草酚藍溶液40mL，pH 7.0，121℃滅菌20min；4)明膠液化實驗培養基：明膠120g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、蒸餾水1L，pH6.8～7.0，121℃滅菌10min；5)淀粉水解實驗培養基：蛋白胨10g、NaCl 5 g、牛肉膏3g、可溶性淀粉2g，pH7.2，121℃滅菌20min；6)硝酸鹽還原實驗培養基：KNO30.2g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、蒸餾水1L，pH7.4，121℃滅菌20min；7)硫化氫產生實驗培養基：牛肉膏3g、酵母浸粉3g、蛋白胨10g、FeSO4· 7H2O 0.2g、Na2S2O30.3g、NaCl 5g、瓊脂12g、蒸餾水1L，pH7.4，121℃滅菌20min；8)纖維素水解實驗培養基：K2HPO42.0g、NH4NO32.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、酵母膏5.0g、纖維素20.0g、pH7.2，121℃滅菌20min；9)V-P實驗培養基：蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2HPO45g、蒸餾水1L，pH7.0，121℃滅菌20min。

1.2 儀器與設備

JNOEC-XS-402型實驗室生物顯微鏡 江南光電(集團)股份有限公司；HD-1630超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；YXQ-SG41-280壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫用核子儀器有限公司；PHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠；TDA-8002水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；HPX-9162MBE數顯電熱培養箱 上海博訊實業有限公司；AUY220EXP電子天平 北京塞多利斯有限公司；UT-1810紫外分光光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；LG10-2.4A離心機 湖南星科科學儀器公司；HZQ-F160全溫振蕩培養箱 哈爾濱市東明醫療儀器廠。

1.3 產膽固醇氧化酶菌株的分離篩選

1.3.1 初篩

稱取樣品各1g，分別加入盛有玻璃珠和100mL無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩20min后，以10%的接種量接入100mL基礎培養基中，37℃、200r/min搖床培養24h。然后將培養液進行梯度稀釋，選取合適的3個梯度，分別為10-4、10-5、10-6涂篩選平板，于37℃倒置培養24h后，挑取不同菌落形態的菌株進行平板劃線分離，得到單菌落，轉接到斜面培養基，4℃保藏。

1.3.2 復篩

將斜面種子挑取一環接入發酵培養基中，37℃、200r/min搖床培養48h。吸取5mL發酵液進行離心(4000r/min，20min)，分別測上清液的酶活力。

1.3.3 膽固醇氧化酶酶活力的測定

采用過氧化氫比色法[10]。在酶的催化過程中，氧化1mol膽固醇可產生1mol過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的作用下，可使4-氨基-安替比林與苯酚形成亞醌類紅色的化合物，在波長500nm處有最大吸收峰，通過測量膽固醇被氧化的量，從而計算出膽固醇氧化酶酶活力。

1.3.3.1 標準曲線的繪制

分別取溶液B(每升溶液B中含4-氨基-安替比林1mmol，苯酚6mmol，pH7.5磷酸鉀緩沖液25mmol，疊氮鈉0.2g，辣根過氧化物酶6000U)3mL于6支試管中，37℃保溫3min；每份分別加入2.584mmol/L的過氧化氫0、50、100、150、200、250μL，反應5min，于波長500nm處測定其吸光度。以過氧化氫濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.3.2 膽固醇氧化酶酶活力的測定

取溶液B(每升溶液B中含4-氨基-安替比林1mmol，苯酚6mmol，pH7.5磷酸鉀緩沖液25mmol，疊氮鈉0.2g，辣根過氧化物酶6000U)3mL，溶液D[溶液D為膽固醇-異丙醇溶液(含Triton X-100，4.26%)0.826%]150μL于試管中，37℃保溫3min，加入50μL發酵上清液，準確反應5min，于沸水中加熱3min，冷卻后，在波長500nm處測吸光度。用標準曲線計算膽固醇氧化酶酶活力。

1.4 高產菌株的確定及菌種鑒定

1.4.1 高產菌株的確定

用過氧化氫比色法測定樣品中膽固醇氧化酶酶活力后，選取高產菌株為目標菌株。

1.4.2 高產菌株的鑒定

1.4.2.1 形態鑒定

采用革蘭氏染色法，用顯微鏡觀察培養24h菌體細胞的形態。

1.4.2.2 生理生化實驗法鑒定

按照《微生物學實驗技術》[11]、《常見細菌系統鑒定手冊》[12]及《伯杰氏細菌鑒定手冊》[13]的方法，對待測菌株分別進行葡萄糖發酵實驗、甲基紅實驗、檸檬酸鹽實驗、接觸酶實驗、明膠液化實驗、淀粉水解實驗、硝酸鹽還原實驗和硫化氫產生實驗，記錄實驗結果。

表1 菌株生理生化實驗結果Table 1 Physiological and biochemical experimental results

2 結果與分析

2.1 產膽固醇氧化酶菌株的分離篩選

2.1.1 初篩

用以膽固醇為單一碳源的篩選平板進行分離，得到不同形態的菌株23株，選擇培養基平板生長狀態見圖1。

圖1 選擇培養基平板Fig.1 Selection of culture medium

2.1.2 復篩

將23株初篩菌株接入發酵培養基中，37℃，200r/min搖床培養48h，離心，分別測上清液酶活力。得到8株上清液酶活力相對較高的菌株，確定這8株菌株可產胞外膽固醇氧化酶，其中菌株A3酶活力可達525U/L。所以確定菌株A3為本實驗的目標菌株。

2.2 膽固醇氧化酶酶活力的測定

以過氧化氫濃度為縱坐標，A500nm為橫坐標，繪制過氧化氫標準曲線如圖2。

圖2 過氧化氫濃度標準曲線Fig.2 Standard curve of hydrogen peroxide

膽固醇氧化酶酶活力定義為：在37℃，pH7.5，1min內，催化1μmol膽固醇氧化為膽甾-4-烯-3-酮所需的酶。根據酶活力定義和過氧化氫濃度標準曲線方程，可以得出酶活力的計算公式為：

式中：A500nm為反應液吸光度；V為反應液體積/ mL；n為酶液稀釋倍數；t為反應時間/min。

2.3 高產菌株的確定及菌種鑒定

2.3.1 形態鑒定

將菌株A3在固體基礎培養基上，37℃培養24h，菌落呈乳白色，表面有光澤，扁平，圓形邊緣整齊。用顯微鏡觀察培養24h菌體細胞的形態，菌體細胞呈桿狀，形狀規則，無分枝，經革蘭氏染色檢驗，菌體呈藍紫色，確定為革蘭氏陽性菌，見圖3。

圖3 菌株A3菌落形態及革蘭氏染色圖片Fig.3 Strain A3 colonies and Gram staining

2.3.2 生理生化實驗鑒定

對待測菌株分別進行葡萄糖發酵實驗、甲基紅實驗、檸檬酸鹽實驗等生理生化鑒定實驗后，其各項生理生化特征見表1。根據實驗結果，并參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[13]，初步確定該菌株屬于短桿菌屬(Brevibacterium sp.)。

3 結 論

本實驗從被油脂污染的自然環境中采集到9個樣品，從中分離得到23株以膽固醇為唯一碳源的菌株，并通過復篩得到1株胞外高產膽固醇氧化酶菌株A3，其膽固醇氧化酶的活力可達到525U/L。經過形態學和生理生化實驗的初步鑒定，該菌株屬于短桿菌屬(Brevibacterium sp.)。

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Screening and Identification of Cholesterol Oxidase-producing Strains with High Activity

CAI Dan，ZHANG Na-na，LIU Jing-sheng*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Twenty-three strains using cholesterol as the sole carbon source were isolated from nine samples collected from different locations. One strain with high yield of extracellular cholesterol oxidase was screened and named as strain A3. The highest activity of cholesterol oxidase was 525 U/L. The strain A3 was identified as Brevibacterium sp. through analyzing its morphology, physiological and biochemical characteristics.

cholesterol oxidase；strain；screening

Q93.331

A

1002-6630(2010)09-0202-04

2009-12-30

吉林農業大學青年啟動基金項目(2007027)

蔡丹(1980—)，女，講師，博士研究生，研究方向為乳品科學與功能性食品開發。E-mail：infinite_cd@yahoo.cn

*通信作者：劉景圣(1964—)，男，教授，博士，研究方向為乳品科學與功能性食品開發。E-mail：liujs1007@vip.sina.com.cn