基于麥汁培養基的富硒酵母培養條件優化

劉 杰，陳 智，李衛旗，徐 林，吳根福,*

(1.浙江大學生命科學學院，浙江 杭州 310058；2.浙江楠溪江啤酒有限公司，浙江 溫州 325100)

基于麥汁培養基的富硒酵母培養條件優化

劉 杰1，陳 智2，李衛旗1，徐 林2，吳根福1,*

(1.浙江大學生命科學學院，浙江 杭州 310058；2.浙江楠溪江啤酒有限公司，浙江 溫州 325100)

以啤酒酵母為材料，對富硒酵母的最適培養條件進行研究。結果顯示：以2oBx的麥汁培養酵母菌，其生長得率最高，過高的麥汁質量濃度會產生克拉勃脫效應而影響酵母生長。在2oBx的麥汁培養基中適當添加酵母提取物，可顯著提高酵母的生物量，而添加硫酸銨和磷酸二氫鉀對酵母生物量的提高不明顯；添加葡萄糖在一定程度上也能增加酵母的生物量，但這種增加會被硫酸銨抑制。培養基中的初始硒含量能顯著影響酵母的生物量和細胞中硒的積累，在初始質量濃度為10mg/L(最終質量濃度為50mg/L)的Na2SeO3初始質量濃度下培養24h，酵母的生物量可達2.83g/L，細胞中積累的總硒量為266.3mg/kg。

富硒酵母；麥芽汁；克拉勃脫效應；亞硒酸鈉

硒是一種人和動物必需的微量元素[1]，作為谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶、碘化甲腺氨酸脫碘酶、硒磷酯合成酶等酶蛋白催化活性中心的組分[2]，在過氧化物的分解、自由基的清除、膜磷脂氫過氧化物的還原等生理反應中起著十分重要的作用，具有保護細胞膜，特別是動脈血管壁上皮細胞細胞膜，防止動脈粥樣硬化，減少血栓和心肌梗塞發生等功能[3-4]。此外，硒還參與機體免疫力的調節[5]、有毒元素的拮抗等生理活動[6]。硒缺乏不僅會引起克山病和大骨節病，還可導致白內障、肝壞死、胰腺纖維化等疾病[7-8]。為此，世界衛生組織于1973年將硒歸類為人和動物必需的微量元素，并建議成人每天補充200μg的硒，以有效預防缺硒引起的疾病。同年，美國FDA也批準亞硒酸鈉和硒酸鈉可作為飼料添加劑應用于動物養殖業。

自然界中的硒主要以無機硒的形式存在。雖然無機硒也能參與肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶的合成，對缺硒引起的疾病具有預防和治療作用，但無機硒主要通過單純擴散的方式吸收，生物利用率低；在高攝食下會促進氧化反應的發生，具有一定生物毒性。而有機硒主要通過甲硫氨酸轉運系統主動吸收，具有食用安全性高，生物利用率強等優點，因而成為補硒添加劑的首選[9]。有報道顯示，富硒酵母對大鼠的LD50為37.3mg/kg，遠高于亞硒酸鈉的5mg/kg[9]。在有機硒的開發上，國內外已生產出富硒茶、富硒米、富硒豆芽等產品，但要實現工業化生產，最好的途徑還是進行富硒酵母的生產[10]。但目前有關富硒酵母發酵生產的報道還不多，對

其最適宜的培養條件還不是很清楚，沈昌等[11]曾以12oBx的糙米汁為主要原料對富硒酵母的發酵動力學進行過研究，確定了適宜的培養條件和硒添加方式。但是糙米是一種以淀粉為主要成分的基質，所含的蛋白質十分有限，而酵母特別是富硒酵母的生長和代謝需要十分豐富的氮源。一般認為麥芽汁是酵母生長和繁殖的理想培養基，但有關以麥芽汁為培養基的富硒酵母生產還未見系統的報道。以麥芽汁為培養基對啤酒酵母進行最適發酵條件和富硒條件的研究，將為富硒酵母的開發提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 浙江大學生命科學學院。

1.2 培養基

1.2.1 麥芽汁培養基

8kg麥芽經粉碎后，加至有40L水的糖化鍋中，在不斷攪拌下升溫糖化(45℃浸出30min，52℃保溫30min，63℃糖化30min，70℃碘液反應完全后，繼續維持30min), 78℃滅酶后經麥糟層自然過濾、清液流入煮沸鍋，在煮沸過程中加入70g顆粒狀啤酒花，1kg葡萄糖并補水至50L，煮沸30min后泵至回旋沉淀槽，冷卻，上層清液即為制備所得麥芽汁[12]。實驗用麥芽和啤酒花購自杭州啤酒廠。

1.2.2 YEPD培養基

酵母提取物5g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、蒸餾水1000mL，pH值自然。

上述培養基經0.05MPa滅菌30min，備用。

1.3 麥汁理化指標的測定

按GB/T4928—2001《啤酒分析方法》進行，具體方法見文獻[13]。

1.4 啤酒酵母的培養及生長量的測定

250mL三角瓶中裝50mL培養基，滅菌后接入5mL培養至對數生長后期的啤酒酵母，30℃，180r/min搖瓶培養，每隔3h取樣測定酵母生長量。酵母生長量以培養液在波長560nm處的吸光度來表示。

1.5 酵母生物量、生長得率的測定

酵母生物量以每升培養液中酵母菌體的干質量(g干質量/L培養液)來表示；酵母生長得率以每消耗1克葡萄糖所收獲的酵母菌體干質量來表示；相對酵母生長得率以各Na2SeO3濃度下的生長得率與未添加Na2SeO3時的生長得率的比值(百分比)來表示，以未添加Na2SeO3時的生長得率作為100%。

干質量的測定：將培養液在5000×g的轉速下離心20min，去上清液，沉淀用雙蒸水離心洗滌2次，60℃烘干后稱質量。

1.6 酵母中硒含量的測定

用氫化物原子熒光光譜法，按GB/T5009.93—2003《食品中硒的測定》進行[14]，具體參數為：負高壓340V，燈電流100mA，原子化溫度800℃，爐高8mm，載氣流速500mL/min，屏蔽氣流速1000mL/min，延遲時間1s，讀數時間15s，加液時間8s，進樣體積2mL。結果以每千克酵母菌體(干質量)所含總硒的毫克數來表示。

1.7 統計方法

正交試驗的方差分析用SPSS16.0統計軟件，組間均數的兩兩比較用Student Newman Keuls Test 法[15]。

2 結果與分析

2.1 麥芽汁的理化性質

對實驗室制備的麥芽汁進行理化性質的測定，結果見表1。各項指標基本符合優質麥汁的理化標準[12]，由于添加的輔助原料較少，麥汁中的氨基氮含量比較豐富，有利于酵母菌的生長和繁殖。

2.2 麥芽汁培養基和YEPD培養基中酵母的生長

圖 1 麥芽汁糖度對酵母生長的影響Fig.1 Effect of beerwort concentration on the growth ofSaccharomyces cerevisiae

表 1 實驗室制備麥汁的理化指標Table 1 Physico-chemical characteristics of prepared beerwort

麥芽汁是酵母生長的良好培養基，一般啤酒廠制備的麥芽汁糖度都在10oBx左右，可是啤酒生產是一種以積累代謝產物(主要是酒精)為主的發酵，而富硒酵母的培養是一種以菌體為收獲對象的發酵，因此需要較低的碳氮比。為此，進行了富硒酵母培養的最適麥芽汁質

量濃度的實驗，并以實驗室酵母培養時常用的YEPD培養基作為對照，根據發酵液在波長560nm時的吸光度來判斷酵母的生長狀況，結果見圖1(實驗重復3次，結果相近，圖中數據為平均值)。

從圖1可以看出，隨著麥芽汁質量濃度的增高，酵母的生長量也相應增加。4oBx和6oBx的麥芽汁，雖然營養物質質量濃度分別比2oBx麥汁增加了1倍和2倍，但其30h的生長量卻只增加27%和58%，這可能與該酵母菌株在高糖質量濃度培養時發生克拉勃脫效應有關[16]。

YEPD培養基中雖然糖的質量濃度也只有2%，但30h的生長量與4oBx的麥汁相近，說明培養基中的酵母提取物和蛋白胨不僅能提供酵母生長所需的微量元素和維生素，還為酵母的生長提供了碳源和氮源[17]。

2.3 影響酵母生物量的主要因素

雖然用2oBx的麥芽汁進行酵母培養時生長得率最高，但培養至穩定期時酵母懸液的光密度為5.03，只有文獻報道最大吸光度的一半[18]。為了確定影響酵母生物量的影響因素，以獲得單位時間內的最大得率，提高設備利用率，以2oBx 的麥芽汁為基礎培養基，進行了添加葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀和酵母提取物的四因素二水平正交試驗，采用L8(27)正交表。結果見圖2及表2、3。

圖2 添加碳、氮、磷源對酵母生長的影響Fig.2 Effect of carbon, nitrogen and phosphorus sources on the growth ofSaccharomyces cerevisiae

從圖2可以看出，在2oBx的麥汁中添加了0.5%酵母提取物后，酵母的生長量有了顯著的提高，而添加氮、磷的試驗組中生長量提高得并不多。方差分析(表3)也表明，如果不考慮交互作用，從4個因素獨立來看，添加了0.5%酵母提取物后，30h培養液中酵母生物量有了極顯著的提高(P＜0.01)，說明2oBx的麥汁培養酵母得率不高的原因是各種營養物質偏少引起的。考慮到4oBx的麥汁或6oBx的麥汁培養時酵母得率提升不明顯，確定在2oBx的麥汁基礎上添加0.5%酵母提取物和2%葡萄糖作為酵母培養的最適培養基配方。

表 2 啤酒酵母培養正交試驗及結果Table 2 Orthogonal experimental results in cultivation ofSaccharomyces cerevisiae

表 3 正交試驗結果方差分析表Table 3 ANOVA analysis of orthogonal experimental design

2.4 Na2SeO3添加量對啤酒酵母生長的影響

硒雖然是一種生物必需的微量元素，但質量濃度過高會顯示出毒性，對酵母細胞的生長起抑制作用[19]。為了確定酵母培養時最適的硒添加量，在上述篩選得到的最適培養基配方的基礎上，進行不同硒初始質量濃度對酵母生長的影響實驗，培養24h后測定菌體生長得率，發現硒能顯著抑制啤酒酵母菌的生長，即使在10mg/L的Na2SeO3·5H2O(相當于3mg/L的硒)質量濃度下，抑制率也達到26.7%(圖3)。所以，為了得到較多的硒酵母，初始硒添加量不能太高。

圖3 硒添加量對酵母生長得率的影響Fig.3 Effect of selenium concentration on relative yield ofSaccharomyces cerevisiae

2.5 酵母細胞中的硒含量

因為超過30mg/L的初始Na2SeO3·5H2O(相當于9mg/L的硒)會使酵母細胞的得率減少一半以上，在進行富硒

酵母培養時，于接種前(0h)在上述最適培養基中分別添加5～30mg/L的Na2SeO3·5H2O，然后培養至12、16、19、22h后各加10mg/L的Na2SeO3·5H2O，使培養基中總的Na2SeO3·5H2O添加量達到45～70mg/L(相當于13.5～21mg/L硒)。培養24h離心收獲菌體，烘干后測定酵母生物量及細胞所固定的硒含量，發現10mg/L的初始Na2SeO3·5H2O添加量既有利于獲得相對較高的酵母生物量2.83g/L，又有利于細胞中硒的富集(266.3mg/kg) (圖4)。更高的初始Na2SeO3·5H2O添加量雖然會增加酵母細胞對硒的吸收，但因酵母的生長受到抑制，每升發酵液中酵母所固定的硒量反而有所減少。

圖 4 初始硒質量濃度對酵母細胞硒積累的影響Fig.4 Effect of initial selenium concentration on selenium accumulation in yeast

3 討 論

雖然4oBx和6oBx麥芽汁的營養物質質量濃度比2oBx麥汁高1～2倍，但是酵母的生長量只增加27%和58% (圖1)，這可能是因為在高糖條件下酵母的呼吸作用被抑制，經EMP途徑產生的部分丙酮酸沒有進入TCA循環，而被底物水平磷酸化，產生乙醇等代謝產物[16]。所以無論從酵母細胞的生長得率來看，還是從酵母培養后的廢液處理難度來看，用2oBx的麥汁來培養顯得更經濟。

在2oBx的麥汁中添加了0.5%酵母提取物后，酵母的生長量有了顯著的提高，而加氮、磷的試驗組中酵母生長量提高并不明顯(圖2)。雖然添加2%葡萄糖后，酵母生物量的增加總體上達到顯著水平(P＜0.05)，但同時添加葡萄糖和硫酸銨(組別Ⅳ)后生物量反而比對照(組別Ⅰ)低(表2、3)，說明硫酸銨與葡萄糖具有協同效應，同時過量存在的情況下能抑制酵母菌的增殖，通過比較組別Ⅶ和組別Ⅷ的酵母生物量，可以得出同樣的結論。其機理目前還不是很清楚，可能與酵母細胞中糖原和蛋白質的貯存有關。

Na2SeO3對酵母的抑制作用主要由培養基中的初始硒質量濃度決定，因為酵母的接種量只有5%，起始培養時酵母細胞數較少，且處于適應期，對環境因子的作用比較敏感。12h后酵母的生長已進入對數生長期，酵母細胞以指數方式增長，此時少量分批地加入Na2SeO3對酵母細胞幾乎沒有抑制作用。初始硒質量濃度在10、20、30mg/L時培養所得的酵母菌體中固定的硒量相差不大，而初始硒質量濃度在5mg/L時酵母菌體中所固定的硒量較少，說明硒是在酵母繁殖時同化至菌體細胞中的，因為酵母在最初12h培養過程中積累的生物量大約占總生物量的一半(圖2)。這一實驗結果還說明酵母利用無機硒的效率不高，因為即使起始Na2SeO3質量濃度為10mg/L，每升發酵液中添加的總硒量達3mg；而每升發酵液培養24h后能得到的酵母生物量(干質量)不足4g(表2)，按每克酵母能固定0.3mg硒(圖4)計算，所需的硒也不過是1.2mg，說明添加的硒大部分還留在培養基中，沒有被酵母同化。但培養基中硒質量濃度低時，不易被運送到酵母細胞內，因為亞硒酸鈉主要是通過單純擴散的方式吸收的[20]。因此，為了得到具有較多生物硒的酵母菌體，以選用10mg/L的初始硒質量濃度為好，若用5mg/L初始硒質量濃度，應在培養至6h時再加5mg/L的硒，以利于酵母的吸收同化。

一個酵母細胞理論上能夠結合的最大硒量依賴于細胞中甲硫氨酸和半胱氨酸(殘基)的含量[10]，大約為6000mg/kg。然而，硒代氨基酸完全替代甲硫氨酸和半胱氨酸是不可能的，這不僅是因為培養環境中存在著與硒起競爭作用的硫，更主要的是由于硒代半胱氨酸的摻入需要密碼子UGA(一般情況下是作為蛋白質翻譯的終止密碼子)的介導[2]。如在谷胱甘肽過氧化物酶分子中，存在著2個半胱氨酸殘基，只有活性中心(第35位)的那一個可以被硒代半胱氨酸取代，另一個半胱氨酸殘基不能被取代，說明生物能特異地識別硒代半胱氨酸的密碼子，因此并非所有半胱氨酸殘基中的硫都能被硒所取代。而細胞中積累較多的硒代半胱氨酸也是不現實的，因為過多的半胱氨酸會引起Fenton反應，產生大量自由基，從而影響細胞的代謝。所以，要獲得富硒酵母，有必要進一步篩選能在細胞內積累大量硒蛋氨酸的酵母菌種。

綜上所述，在分批培養過程中，高質量濃度的培養基不利于生長得率的提高，低質量濃度的培養基又會降低設備的利用率，用補料分批培養或連續培養來進行富硒酵母的發酵可能是一種比較合適的方式。

[1]ROTRUCK J T, POPE A L, GANTHER H E, et al. Selenium∶ Biochemical role as a component of glutathione peroxidase[J]. Science, 1973, 179(74)∶ 588-590.

[2]ZINONI F, BIRKMANN A, STADTMAN T C, et al. Nucleotide sequence and expression of the selenocysteine-containing polypeptide of formate dehydrogenase (formate-hydrogen-lyase-linked) from Escherichia coli[J]. PNAS USA, 1986, 83(13)∶ 4650-4654.

[3]QIN Shunyi, HUANG Kehe, GAO Jianzhong, et al. Comparison of glutathione peroxidase 1 and iodothyronine deiodinase 1 mRNA expres-

sion in murine fiver after feeding selenite or selenized yeast[J]. J Trace Elem Med Biol, 2009, 23(1)∶ 29-35.

[4]OGNJANOVIC B I, MARKOVIC S D, PAVLOVIC S Z, et al. Effect of chronic cadmium exposure on antioxidant defense system in some tissues of rats∶ Protective effect of selenium[J]. Physiol Res, 2008, 57(3)∶403-411.

[5]ARTHUR J R, McKENZIE R C, BECKETT G J. Selenium in the immune system[J]. J Nutr, 2003, 133(5)∶ 1457-1459.

[6]OTHMAN A I, MISSIRY M A. Role of selenium against lead toxicity in male rats[J]. J Biochem Mol Toxicol, 1998, 12(6)∶ 345-349.

[7]李繼云. 防治大骨節病的新途徑∶ 改良低硒環境與補硒效果研究[M].北京∶ 中國科學技術出版社, 1992.

[8]SCHWARZ K, FOLTZ C M. Selenium as an integral part of factor 3 against dietary necrotic liver degeneration[J]. J Amer Chem Soc, 1957, 79∶ 3292-3293.

[9]DUMOUT E, VANHAECKE F, CORNELIS R. Selenium speciation from food source to metabolites∶ a critical review[J]. Anal Bioanal Chem, 2006, 385(7)∶ 1304-1323.

[10]SCHRAUZER G N. Selenium yeast∶ Composition, quality, analysis, and safety[J]. Pure Appl Chem, 2006, 78(1)∶ 105-109.

[11]沈昌, 印宏緋, 顧振新, 等. 以糙米為主要原料的富硒酵母發酵動力學研究[J]. 食品工業科技, 2009, 30(3)∶ 162-163; 167.

[12]吳根福. 發酵工程實驗指導[M]. 北京∶ 高等教育出版社, 2006.

[13]中國標準出版社總編室. 中國國家標準匯編∶ 啤酒分析方法[S]. 北京∶ 中國標準出版社, 2003.

[14]中華人民共和國衛生部. 食品衛生檢驗方法∶ 理化部分[S]. 北京∶ 人民體育出版社, 2006.

[15]張力. SPSS在生物統計中的應用[M]. 廈門∶ 廈門大學出版社, 2008.

[16]POSTMA E, VERDUYN C, SCHEFFERS W A, et al. Enzymic analysis of the crabtree effect in glucose-limited chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae[J]. Appl Environ Microbiol, 1989, 55(2)∶ 468-477.

[17]沈萍. 微生物學[M]. 北京∶ 高等教育出版社, 2000.

[18]YIN Hongfei, CHEN Zhigang, GU Zhenxin, et al. Optimization of natural fermentative medium for selenium-enriched yeast by D-optimal mixture design[J]. LWT-Food Science and Technology, 2009, 42(1)∶327-331.

[19]SUHAJDA A, HEGOCZKI J, JANZSO B, et al. Preparation of selenium yeasts I. preparation of selenium-enriched Saccharomyces cerevisiae[J]. Journal of Trace Element in Medicine and Biology, 2000, 14(1)∶ 43-47.

[20]JUNIPER D T, PHIPPS R H, RAMOS-MORALES E, et al. Effects of dietary supplementation with selenium enriched yeast or sodium selenite on selenium tissue distribution and meat quality in lambs[J]. Anim Feed Sci Technol, 2009, 149(3)∶ 228-239.

Optimal Condition for Selenium-rich Yeast Cultivation in Beerwort Media

LIU Jie1，CHEN Zhi2，LI Wei-qi1，XU Lin2，WU Gen-fu1,*
(1. College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China；2. Zhejiang Nanxi River Brewery Company Limited, Wenzhou 325100, China)

The optimal cultivation condition for yeast growth and selenium accumulation in beerwort media was studied. Results indicated that 2oBx beerwort was a suitable medium for the growth of Saccharomyces cerevisiae and the higher concentration would reduce growth rate by Crabtree effect. The addition of yeast extract in 2oBx beerwort could significantly increase yeast biomass; while the addition of (NH4)2SO4or KH2PO4did not. In addition, although glucose addition also could improve yeast biomass, its enhancement effect could be inhibited by simultaneous addition of (NH4)2SO4. Initial selenium concentration in media could remarkably improve yeast biomass and enhance selenium accumulation. At the initial concentration of 10 mg/L Na2SeO3, yeast biomass and accumulated selenium reached up to 2.83 g/L and 266.3 mg/kg, respectively.

selenium-rich yeast；beerwort；Crabtree effect；Na2SeO3

TS201.3

A

1002-6630(2010)09-0206-05

2009-10-11

劉杰(1985—)，男，碩士研究生，主要從事微生物方面的研究。E-mail：liujie1505@163.com

*通信作者：吳根福(1965—)，男，副教授，博士，主要從事微生物方面的研究。E-mail：wugenfu@zju.edu.cn