米糠抗氧化肽大鼠體外抗氧化作用研究

樊金娟，羅 霞，付巖松，張幼竹，劉廣文

(沈陽農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，遼寧 沈陽 110161)

米糠抗氧化肽大鼠體外抗氧化作用研究

樊金娟，羅 霞，付巖松，張幼竹，劉廣文

(沈陽農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，遼寧 沈陽 110161)

對米糠抗氧化肽體外抗氧化作用進行研究。結(jié)果顯示，米糠抗氧化肽(0.32mg/mL)能夠抑制血紅蛋白氧化反應(yīng)和紅細胞溶血，抑制率為50%左右，表明其對大鼠紅細胞和血紅蛋白的氧化損傷具有保護作用；米糠抗氧化肽能抑制紅細胞及肝組織自氧化產(chǎn)生的MDA和由H2O2誘導產(chǎn)生的MDA，抑制率為41%～60%；并能抑制自由基誘導的大鼠肝組織勻漿中脂褐質(zhì)的產(chǎn)生。

米糠抗氧化肽；抗氧化；體外

抗氧化劑是生物體實現(xiàn)自我保護的最根本性機制。在生物體內(nèi)，自由基的增多對生物大分子和膜結(jié)構(gòu)均有不同方式的損傷作用，造成相關(guān)細胞結(jié)構(gòu)與功能的破壞，導致疾病的發(fā)生[1]。來源于食物蛋白水解物的肽類，不僅具有很高的營養(yǎng)價值，而且無論是從細胞生理學還是代謝功能上越來越顯示出優(yōu)勢。它們與機體的各種功能調(diào)節(jié)、疾病的發(fā)生以及免疫、內(nèi)分泌、衰老、代謝等有著非常密切的關(guān)系，在生命活動中起著非常重要的作用，可廣泛用作藥物、疫苗和食品營養(yǎng)制劑等。

本實驗以米糠蛋白酶解物經(jīng)分子篩層析、離子交換層析等分離純化過程獲得的米糠抗氧化肽為原料，從體外實驗研究米糠抗氧化肽的抗氧化活性，為深入研究米糠肽生物活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

米糠抗氧化肽的制備、分離純化，按本實驗室方法進行[2]。

Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量200g左右，由長春醫(yī)學實驗動物研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 米糠抗氧化肽對血紅蛋白氧化反應(yīng)的影響[3-4]。

Wistar大鼠斷頭取血，制成抗凝血，以1500r/min，4℃離心5min得紅細胞，用冷生理鹽水洗3次，用pH7.4的PBS配成20%的紅細胞懸液5mL，加入20倍5mmol/L的低滲PBS，4℃溶血30min，18000r/min離心30min，取上清液。1)自氧化體系：取溶血液2mL，加入0.32mg/mL的米糠抗氧化肽100μL，37℃溫育24h；兩支對照管加入100μL蒸餾水，其中一支37℃溫育24h；2)H2O2啟動的氧化體系：加樣方式同自氧化體系，3 7℃溫育10min，加入30mmol/L的H2O2100μL，37℃振蕩溫育45min，于500～700nm波長處，2nm/s掃描。

1.2.2 米糠肽對大鼠紅細胞過氧化溶血的影響[5-7]。

1)紅細胞自氧化溶血系統(tǒng)：取1%紅細胞懸液10mL，分別加入0.16、0.24、0.32mg/mL米糠抗氧化肽及0.24mg/mL GSH 100μL，對照管加100μL蒸餾水，

37℃溫育24h。2) H2O2誘發(fā)的紅細胞氧化溶血系統(tǒng)：加樣方法同1)，37℃溫育10min，加入終濃度為100mmol/L的H2O2，37℃振蕩溫育60min。將各系統(tǒng)在1000r/min離心10min，上清液于415nm測定吸光度，計算紅細胞氧化溶血抑制率。另取上清1 m L，用硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA含量[8]。

式中：A0為對照管吸光度；A為樣品管吸光度。

1.2.3 米糠抗氧化肽對大鼠肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化的影響

1.2.3.1 米糠抗氧化肽對大鼠肝組織勻漿丙二醛(MDA)含量的影響[9-10]。

取5%肝勻漿2mL，分別加入0.16、0.24、0.32mg/mL米糠抗氧化肽及0.24mg/mL GSH 100μL，對照管加入100μL蒸餾水，37℃溫育10min，加入終濃度為1mmol/L的H2O2，37℃反應(yīng)30min。取出反應(yīng)液1mL，TBA法測定MDA含量。

1.2.3.2 米糠抗氧化肽對大鼠肝組織勻漿脂褐質(zhì)含量的影響

參照文獻[11]，稍加改進。取5%的肝組織勻漿5mL，分別加入0.16、0.24mg/mL米糠抗氧化肽及0.24mg/mL GSH 200μL，對照加等量蒸餾水，37℃溫育10min，加入終濃度為12mmol/L 的H2O2，37℃反應(yīng)150min。各管加入體積比2∶1的氯仿甲醇液5mL混勻，3000r/min離心10min，向提取液中加入甲醇0.2mL，輕振混勻，置紫外燈下照射30s，用熒光分光光度計在波長300～400nm范圍內(nèi)掃描最大激發(fā)波長，然后以該波長在400～500nm范圍內(nèi)進行發(fā)射波長掃描，熒光強度代表脂質(zhì)過氧化程度。

1.2.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠抗氧化肽對血紅蛋白氧化反應(yīng)的影響

氧合血紅蛋白是血紅蛋白和氧分子的絡(luò)合物。血紅素鐵原子為二價，與O2、卟啉的4個N、珠蛋白的組氨酸殘基(咪唑基)結(jié)合，成為八面體的絡(luò)合物，分別在540nm(血紅蛋白β鏈)和575nm(血紅蛋白α鏈)波長處有特異吸收峰。高鐵血紅蛋白(MetHb)及血紅蛋白鐵喪失一個電子，在630nm波長有特異吸收峰。正常高鐵血紅蛋白占血紅蛋白總量的1%，較為穩(wěn)定。

當紅細胞發(fā)生氧化后，氧合血紅蛋白的吸收峰降低，其中α鏈最為敏感；而高鐵血紅蛋白的吸收峰增高(圖1、2)，更易加速類脂的過氧化，從而導致細胞損傷。

圖1 米糠抗氧化肽對大鼠紅細胞自氧化體系中血紅蛋白含量的影響Fig.1 Effect of rice bran peptides on hemoglobin of red blood cells in autoxidation system

圖2 米糠抗氧化肽對大鼠紅細胞H2O2誘導氧化體系中血紅蛋白含量的影響Fig.2 Effect of rice bran peptides on hemoglobin of red blood cells in H2O2-induced oxidation system

由圖1、2可知，米糠抗氧化肽無論對自氧化體系還是H2O2誘導氧化體系中的血紅蛋白氧化反應(yīng)都有一定的抑制作用，抑制率分別為20.86%和22.17%。Stratford等[12-13]曾報道，內(nèi)脂可加速Hb的氧化速率，異丙酚能抑制脂質(zhì)誘發(fā)的這種加速作用，但并不抑制潛在的氧自由基誘發(fā)的氧化反應(yīng)。由此推斷，米糠抗氧化肽對紅細胞自由基損傷的保護作用可能與異丙酚相似，主要通過對細胞膜脂質(zhì)過氧化的抑制作用，從而保護紅細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，而對Hb氧化作用的影響可能是次要的。

2.2 米糠抗氧化肽對大鼠紅細胞過氧化的影響

紅細胞是血液中的主要功能成分，擔負著運輸O2，排出CO2的重要任務(wù)。紅細胞膜中含有大量不飽和脂肪酸，在氧分壓過高時，可使紅細胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化產(chǎn)生MDA，而MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一，它可以交聯(lián)磷酯和蛋白質(zhì)，也可以使蛋白質(zhì)巰基氧化，從而損傷細胞膜，使之產(chǎn)生溶血[14-15]。在正常生理情況下，由于內(nèi)源性抗氧化劑的保護作用，紅細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能基本得到維持，但在疾病、衰老、環(huán)境毒物及受到輻射損傷情況下自由基對紅細胞膜的損

傷程度可能超過其修復能力，導致膜損傷而發(fā)生氧化溶血作用。通過紅細胞的氧化溶血反應(yīng)可以檢測自由基損傷程度，也可以通過該反應(yīng)來評價抗氧化劑的抗氧化效果。

2.2.1 米糠抗氧化肽對大鼠紅細胞過氧化溶血的影響

表1 米糠抗氧化肽對大鼠紅細胞過氧化溶血的影響Table 1 Effect of rice bran peptides on hemolysis of red blood cells

由表1可知，和對照組相比，在0.16～0.32mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著米糠抗氧化肽質(zhì)量濃度的增加，對溶血反應(yīng)的抑制作用增加，且具有顯著作用(P＜0.01)。

雙氧水是很強的自由基誘導劑，在大鼠紅細胞溶液中添加后促進了紅細胞的過氧化溶血反應(yīng)。與對照組相比，在0.16～0.32mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著米糠抗氧化肽質(zhì)量濃度的增加，對溶血反應(yīng)的抑制作用也增加，且具有顯著作用(P＜0.01)。通過與GSH的比較可知，米糠抗氧化肽抑制溶血的能力可與GSH相媲美。

2.2.2 米糠抗氧化肽對大鼠紅細胞MDA含量的影響

表2 米糠抗氧化肽對大鼠紅細胞MDA含量的影響Table 2 Effect of rice bran peptides on MDA content in red blood cells

由表2可知，與對照組相比，在0.16～0.32mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，米糠抗氧化肽各劑量組對大鼠紅細胞自氧化和H2O2誘導生成的MDA均有顯著的抑制作用(P＜0.01)，說明米糠抗氧化肽在紅細胞水平上的抗氧化作用明顯。通過與GSH的比較可知，米糠抗氧化肽抑制MDA生成的能力與GSH相當。

2.3 米糠抗氧化肽對大鼠肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化的影響肝組織是動物重要的代謝器官，其勻漿液中含有大量的細胞器和質(zhì)膜，在體外溫育過程中可以發(fā)生自氧化反應(yīng)產(chǎn)生自由基，而這些自由基能通過攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化，并形成脂質(zhì)過氧化物。因此，測定MDA的含量不僅可反映出組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，還能間接體現(xiàn)出細胞損傷程度。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一，它可以交聯(lián)磷脂和蛋白質(zhì)，也可以使蛋白質(zhì)的巰基氧化生成脂褐質(zhì)。通過對脂褐質(zhì)的測定，可知細胞被自由基損傷的程度，間接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平。

2.3.1 米糠抗氧化肽對大鼠肝組織勻漿MDA含量的影響

表3 米糠抗氧化肽對大鼠肝組織勻漿MDA含量的影響Table 3 Effect of rice bran peptides on MDA content in liver tissue

由表3可知，與H2O2誘導對照組相比，在0.16～0.32mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，米糠抗氧化肽各劑量組對大鼠肝組織勻漿H2O2誘導組生成的MDA有顯著的抑制作用(P＜0.01)，說明米糠抗氧化肽在肝組織水平上的抗氧化作用明顯。通過與GSH的比較可知，米糠抗氧化肽的抗氧化作用稍優(yōu)于GSH。

2.3.2 米糠抗氧化肽對大鼠肝組織勻漿脂褐質(zhì)含量的影響

脂褐質(zhì)是丙二醛與游離的氨基類物質(zhì)(如磷脂酰乙醇胺，蛋白質(zhì)及核酸)交聯(lián)而生成的具有熒光的化合物，即Shill堿。用氯仿-甲醇混合為萃取劑，可將其從組織中提取出來。通過對脂褐質(zhì)的測定，可知道細胞被自由基損傷的程度，間接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平。通過熒光分光光度計在300～400nm范圍內(nèi)掃描得最大激發(fā)波長為359.6nm；然后在359.6nm最大激發(fā)波長下，在400～500nm范圍內(nèi)進行掃描得最大發(fā)射波長為431.3nm。在此波長下，測得米糠抗氧化肽對脂褐質(zhì)產(chǎn)生的影響。

表4 米糠抗氧化肽對大鼠肝組織勻漿脂褐質(zhì)生成的影響Table 4 Effect of rice bran peptides on the generation of lipofasci in liver tissue

由表4可知，肝組織勻漿在H2O2誘導產(chǎn)生的自由基損傷作用下，形成了脂褐質(zhì)。與對照組相比，米糠抗氧化肽和GSH對脂褐質(zhì)的生成都有顯著抑制作用(P＜0.01)，且二者抑制能力接近。

3 結(jié) 論

3.1 米糠抗氧化肽可減緩自發(fā)體系和誘導體系中血紅蛋白被氧化的速率，對血紅蛋白有一定保護作用。

3.2 米糠抗氧化肽在0.16～0.32mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)各劑量組能極顯著地抑制紅細胞的過氧化溶血和丙二醛的生成，并呈一定的量效關(guān)系。

3.3 米糠抗氧化肽在0.16～0.32mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)各劑量組能顯著抑制肝勻漿的過氧化反應(yīng)。

自由基的增多會引起蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子的氧化損傷，甚至破壞細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，導致疾病的發(fā)生。動物體外實驗表明，米糠抗氧化肽能夠抑制血紅蛋白氧化速率及紅細胞過氧化溶血，同時能降低肝組織MDA和脂褐質(zhì)的產(chǎn)生，其抗氧化活性可與GSH相媲美，為進一步研究米糠抗氧化肽的體內(nèi)抗氧化活性及相關(guān)免疫調(diào)節(jié)活性提供了參考。

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Antioxidant Effect of Rice Bran Peptides in Rats

FAN Jin-juan，LUO Xia，F(xiàn)U Yan-song，ZHANG You-zhu，LIU Guang-wen
(College of Biotechnology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)

In this study, biological functions of rice bran antioxidant peptides were investigated. Results indicated that rice bran antioxidant peptides exhibited an effective scavenging capability to free radicals and inhibit peroxide reactions of hemoglobin and hemolysis of red blood cells (RBC); moreover, rice bran antioxidant peptides also revealed an excellent inhibition effect on MDA generated from RBC, liver tissue and H2O2 oxidation system. Furthermore, rice bran antioxidant peptides also could suppress the generation of lipofasci from liver tissues induced by H2O2.

rice bran antioxidant peptide；antioxidation；in vitro

TQ936.16

A

1002-6630(2010)09-0251-04

2009-07-03

遼寧省教育廳重點實驗室項目(2008S207)

樊金娟(1972—)，女，副教授，博士，研究方向為植物資源開發(fā)與利用。E-mail：jinjuanf@hotmail.com