低溫脅迫下植物MAPK反應及LeMAPKs功能的生物信息學預測

丁 洋，趙瑞瑞，申 琳,2，生吉萍,*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.新疆農業大學食品科學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

低溫脅迫下植物MAPK反應及LeMAPKs功能的生物信息學預測

丁 洋1，趙瑞瑞1，申 琳1,2，生吉萍1,*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.新疆農業大學食品科學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK/MPK)級聯是植物響應外界環境變化的重要信號傳導途徑。MAPK級聯參與植物低溫信號轉導過程并在此過程中起信號放大和傳遞的中樞作用。目前人們在植物中發現多種參與低溫脅迫過程的MAPK。本文介紹了植物中與低溫脅迫相關的MAPK研究進展，并通過生物信息學的方法對番茄中具有相關功能的番茄促分裂原活化蛋白激酶(LeMAPKs)進行預測，為進一步研究MAPK級聯在植物低溫信號轉導過程中的作用機制提供參考。

植物；低溫；脅迫；M A P K

與任何其他生物一樣，植物有著各種復雜的信號轉導機制來適應外界環境的變化。植物為了正常的生長和發育需要響應和保護其自身免受一切形式的生物和非生物環境脅迫，而這種將外界刺激信號傳遞到胞內并產生。

響應的過程涉及一個共同的機制就是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)級聯途徑。人們從擬南芥、苜蓿、豌豆和煙草等多種植物中發現了大量MAPK家族成員，但是對不同MAPK級聯途徑的功能和組成成分的研究仍有待深入[1-4]。現已確定植物中MAPK廣泛參與多種環境脅迫，如冷、熱、風、土壤含鹽量、紫外線和臭氧等引起的信號傳導過程[5]。低溫是植物在自然環境中所面對的最主要非生物脅迫因素之一，本文對目前植物中與低溫脅迫相關MAPK的研究進展進行綜述并通過生物信息學的方法，對番茄中具有相關功能的番茄促分裂蛋白激酶(LeMAPKs)進行了預測。

1 促分裂原活化蛋白激酶MAPK級聯系統

蛋白質激酶是一類可以使特定的蛋白質側鏈中的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基共價磷酸化的酶，蛋白質磷酸化可以控制酶的活性及其與其他分子的相互作用[6]。MAPK是絲/蘇氨酸蛋白質激酶的一個大家族，包含11

個保守的亞結構域，現已在真核生物界被廣泛發現[7]。真核生物中的MAPK在將外源刺激信號轉入胞內應答受體/感應器的下游的過程中起著樞紐的作用[8]。在植物中，MAPK級聯途徑與不同的生物及非生物脅迫反應、激素反應、細胞分化和發育過程有關。

MAPK級聯途徑由3種蛋白激酶組成：MAPK激酶之激酶(mitogen activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK/MEKK)、MAPK激酶(mitogen activated protein kinase kinase, MAPKK/MKK)以及MAPK/MPK。在真核細胞內，這3種類型的激酶構成一個MAPK級聯途徑，通過MAPKKK→MAPKK→MAPK逐級磷酸化，將外來信號級聯放大并傳遞下去。MAPKKK位于級聯系統的上游，能夠通過脅迫感受器或信號分子的受體或其本身直接感受胞外刺激而發生磷酸化。MAPKKK磷酸化后變為活化狀態，可以使M A P K K磷酸化[9]。MAPKK又稱MEK(MAPK kinase)，始終存在于細胞質中。MAPKK含有保守的絲氨酸/蘇氨酸-X3-5-絲氨酸/蘇氨酸(S/T-X3-5-S/T，X代表任意氨基酸)基序，上游的MAPKKK通過磷酸化S/T-X3-5-S/T基序中的絲氨酸或絲氨酸/蘇氨酸殘基，從而激活MAPKK。MAPK又稱MPK或者ERK(extra celluar-regulated kinase)，含有一個非常保守的蘇氨酸-X-酪氨酸(T-X-Y，X代表任意氨基酸)基序，MAPK的激活需要上游的MAPKK對它的雙重磷酸化作用，磷酸化位點是T-X-Y基序中的蘇氨酸和酪氨酸殘基[10]，被MAPKK磷酸化后有3種可能的去向：1)停留在細胞質中，激活一系列其他蛋白激酶；2)在細胞質中使細胞骨架成分磷酸化；3)進入細胞核，通過磷酸化特定轉錄因子，調控功能基因的表達，最終引起植物細胞對內外刺激的生理生化反應。不論在植物、動物、微生物中，MAPK級聯是進化上相對保守的信號傳導模式。

2 植物中與低溫脅迫相關的MAPK研究進展

低溫脅迫包括0～12℃之間的冷脅迫(chilling stress)和0℃以下的冰凍脅迫(freezing stress)兩種。植物在與低溫的相互作用中，逐漸形成了一套感知和傳導低溫信號的通路，并產生一系列適應低溫的變化，以增強抗寒性。近年來研究表明，植物冷馴化和抗寒能力的獲得，在分子水平上是植物對逆境產生迅速應答、逆境信號在體內轉導，由此調控應答和抵御基因表達綜合作用的結果[11]。在遭遇低溫時，植物啟動感受低溫信號和將信號向下游傳遞的信號轉導通路。位于細胞壁、質膜和原生質中的信號傳遞體，將外部低溫信號級聯放大，傳遞到細胞核內，誘導低溫響應基因的表達，使植物在較短時間內完成低溫適應和馴化過程。MAPK級聯作為第二信使下游的信號途徑，將低溫信號向下傳遞并給調控轉錄因子，提高或抑制各自作用的靶基因的轉錄，進而調控相關基因的表達，使植物獲得抵御低溫的能力。

植物中已發現的與低溫脅迫相關的MAPK類蛋白激酶主要有1 6種，主要來源于擬南芥、水稻、紫花苜蓿、棉花、玉米。關于植物低溫脅迫相關MAPK類蛋白激酶的研究也主要集中在模式植物上，如擬南芥。Mizoguchi等[12]用4℃低溫刺激擬南芥植株后，通過Northern blot 分析，5min內AtMEKK1和AtMAPK3就被誘導表達，1h內顯著增加，隨后表達持續增加，24h后達高峰。這表明MAPK級聯系統不僅在蛋白水平上受到磷酸化和去磷酸化的調控，在轉錄水平也受到低溫脅迫信號的誘導調控。AtMAPK3基因啟動子克隆分析表明，TATA盒上游有一個低溫有關的DRE(dehydration responsive element)順式作用元件的核心序列(CCGAC)。利用酵母雙雜交系統證明AtMEKK1參與擬南芥植物中傳遞低溫脅迫信號的M A P K級聯途徑，該途徑由AtMEKK1→MEK1→AtMAPK4，與酵母的類似。Mizoguchi等[13]曾報道ATPK19(核糖體蛋白激酶S6)是一種MAPK，它能被冷凍脅迫所激活。低溫可以通過導致植物失水，而引起滲透脅迫。正常情況下，細胞壁和細胞質膜相接觸，質壁之間存在著相互作用，由于質壁的剛性不同，細胞失水質膜收縮時質壁必然相互“撕扯”，這種“撕扯”實際是一種機械作用，而機械作用能被“機械感應器”識別。Bogre等[14]報道這種“機械感應器”是一種MAPK，它在機械刺激后1min就能被激活。“雙組分系統”是細菌中廣泛存在的“滲透感受器”，由EnvZ和OmpR兩種蛋白組成，前者是一個組氨酸激酶，在高滲透壓環境下能發生自身磷酸化，起感應器的作用；后者是反應調節器，含有天冬氨酸殘基，能接受來自EnvZ的磷而被磷酸化，磷酸化的OmpR可作為轉錄因子而將來自EnvZ的信號輸出。

Matsuoka等[15]研究發現，擬南芥受到低溫刺激后AtMEK1的活性升高，并有可能通過激活循環中TEY基序的雙重磷酸化激活其下游的AtMAPK4。這是植物體內MAPKK被激活的第一證據。Teige等[16]研究發現，擬南芥中MAPKK，MKK2能夠被低溫所激活可能通過其上游的MEKK1。此外，酵母雙雜交和蛋白激酶活性分析結果顯示：MAPK4和MAPK6是MKK2的直接的、特異性的底物。Mizoguchi等[17]在發現低溫可以誘導MAPK類蛋白激酶AtMAPK4及AtMAPK6的表達，而這兩種基因的表達只與絲氨酸的磷酸化有關，并不影響mRNA及蛋白質的生成量，并且研究表明這兩種蛋白激酶是存在于兩條不同的級聯通路中的。可見，AtMKK2作為AtMAPK4和AtMAPK6上游激活子調節擬南芥低溫脅迫信號傳遞過程。以上結果表明擬南芥中MEKK1-

MKK2-MAPK4/MAPK6這條途徑在響應低溫脅迫的過程中發揮著重要作用[16]。

目前在水稻中發現的與低溫脅迫相關的MAPK類蛋白激酶主要有OsMAPK2、OsMAPK4、OsMAPK5、OsMAPK8這4種。4℃的低溫能夠誘導水稻幼苗體內的OsMAPK2和OsMAPK4的表達在mRNA水平上升高，然而這種誘導作用僅在低溫處理3h后發生，相對晚于MAPK對刺激的相應時間[18-19]。Xiong等[20]研究發現，冷處理可以誘導水稻中OsMAPK5基因的表達和激酶活性的產生，OsMAPK5超表達的轉基因植株能夠抑制其對冷的敏感性。低溫能夠特異地誘導O s M A P K 8 (OsWJUMK1)的表達，而不能誘導OsMSRMK3和OsMSRMK2[21]。另外，Claudia等[22]使用特異性多肽抗體對紫花苜蓿中的MAPK進行免疫沉淀凝膠激酶檢測，發現冷刺激能夠激活p44MKK4基因的表達和活性的產生，但M K K 4蛋白水平始終是不變的。結果表明，MKK4在ABA非依賴性途徑中調節低溫信號的傳導。有人在棉花中發現了一種新型的M A P K基因——GhMAPK，它參與了響應多種不同的環境脅迫的過程，Northern雜交分析表明，當棉花幼苗受到4℃冷脅迫時，GhMAPK在轉錄水平迅速積累[23]。ZmMEK1是一種從玉米根尖中發現的MAPKK，Hardin等[24]研究發現，ZmMEK1的mRNA在轉錄水平受到低溫脅迫的下調。Berberich等[25]用低溫處理玉米葉片，從25℃快速降到5℃，放置一段時間之后，再返回25℃的環境中。通過Northern雜交分析，此過程中ZmMAPK5的表達在轉錄水平上升，說明ZmMAPK5參與了玉米葉片的低溫脅迫過程。以上結果表明， MA PK級聯途徑參與了植物響應外界低溫信號的過程并在此過程中發揮著重要作用(表1)[12-25]。

表1 植物中低溫脅迫相關的MAPKsTable 1 MAPKs related to low-temperature stress in plants

3 番茄中與低溫脅迫相關LeMAPKs的生物信息學預測

低溫是限制植物生長季節和生長地域的重要環境因子，過度低溫會造成植物受到不同程度的傷害，甚至死亡。它是一種嚴重的自然災害，不僅限制作物的區域分布和生存，還對作物產量有很大影響。番茄是典型的冷敏型果蔬[26]，具有基因組結構相對簡單、生理特點了解較清楚、栽培較容易和經濟價值高等特點，是果實采后生理和病理研究中的一種經典模式材料[27]。探討番茄的低溫信號轉導和基因表達模式對于改善冷敏果蔬抗冷性，提高經濟作物產量均有十分重要的理論與經濟意義和社會效益。

圖1 番茄LeMAPKs和植物低溫脅迫相關MAPKs系統進化樹Fig.1 Phylogenetic relationship between MAPK genes related to low-temperature stress in plants and LeMAPK genes in tomato

MAPK級聯途徑在植物低溫信號轉導過程中起著關鍵的信號傳遞和放大作用，由于番茄基因組測序尚未完成，目前可以獲得的轉錄信息有限，通過生物信息學的方法可以對番茄中具有相關功能的LeMAPKs進行預

測。2007年，Stulemeijer等[28]在TIGR (the Institute for Genomic Research)、NCBI(the National Center for Biotechnology Information)和SGN(SOL Genomics Network)數據庫中鑒定了16條番茄的MAPK序列條目。其中番茄激酶LeMAPK1、LeMAPK2、LeMAPK3已有研究報道，其他激酶的研究還未見文獻報道，L e M A P K 1、LeMAPK2、LeMAPK3在低溫脅迫中的作用也尚未見報道。由于MAPK在真核生物中具有高度保守性，我們將已知植物中低溫脅迫相關的16條MAPKs的mRNA序列與番茄的16條序列進行比對，并構建了系統進化樹，從而為番茄LeMAPKs在低溫脅迫下的研究提供一些借鑒。根據進化樹，可將番茄LeMAPKs分成4組(A～D組)，這與Stulemeijer等[28]的分類相同。植物中低溫脅迫相關M A P K s與番茄有著共同的起源，其中番茄LeMAPK1、2、3和擬南芥AtMAPK6、AtMAPK3、玉米Z m M A P K 5、水稻O s M A P K 5同屬于A組，LeMAPK4-7和擬南芥AtMAPK4水稻OsMAPK2、OsMAPK4同屬于B組，LeMAPK8和LeMAPK9同屬于C組，LeMAPK10-16和水稻OsMAPK8同屬于D組(圖1)。

4 結 語

植物在長期的進化過程中，由于適應環境的需要，逐漸形成了一套完整的對外界刺激的反應機制，包括對外界刺激的感受、信號的放大、傳輸及做出應答。在信號傳遞和應答過程中，MAPK級聯途徑起著非常重要的作用。MAPK級聯在不同層級上存在著不同方式的調控，如磷酸化水平、轉錄水平、轉錄后可變剪接等、翻譯后修飾、細胞定位，同時不同刺激會開啟不同的途徑。級聯反應中的不同成員以及效應因子在不同的途徑中存在著重疊。植物受到低溫脅迫時，膜上受體感受低溫信號后，將信號向下游傳遞。位于MAPK級聯作為信號傳遞體，將外部低溫信號級聯放大，傳遞到細胞核內，誘導低溫響應基因的表達，使植物獲得抗冷性。目前對于植物中參與低溫脅迫的MAPK的研究多集中在模式植物擬南芥上，對番茄MAPK級聯通路的成分、調控方式等信息還不完整，通過生物信息學預測番茄中MAPK的功能，有助于進一步深入研究MAPK級聯途徑在低溫信號轉導過程中的作用機制，闡明低溫信號轉導過程和基因表達的模式，為研究植物抗冷信號轉導機制及其發生和發展規律提供參考。

[1]JONAK C, OKRESZ L, BOGRE L, et al. Complexity, cross talk and integration of plant MAP kinase signaling[J]. Curr Opin Plant Biol, 2002, 5(5)∶ 415-424.

[2]ICHIMURA K, SHINOZAKI K, TENA G, et al. Mitogen-activated protein kinase cascades in plants∶ a new nomenclature[J]. Sci, 2002, 7 (7)∶ 301-308.

[3]TENA G, ASAI T, CHIU W L, et al. Plant mitogen-activated protein kinase signaling cascades[J]. Curr Opin Plant Biol, 2001, 4(5)∶ 392-401.

[4]ZHANG S, KLESSIG D F. MAPK cascades in plant defence signaling [J]. Trends Plant Sci, 2001, 6(11)∶ 520-526.

[5]NEETI S M, RENU T, NARENDRA T. Signaling through MAP kinase networks in plants[J]. Arch Biochem Biophys, 2006, 452∶ 55-68.

[6]GARY L, JOHNSON R L. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases[J]. Science, 2002, 298 (5600)∶ 1911-1912.

[7]CHRISTIAN W, SPENCER G, MATTHEW B. Mitogen-activated protein kinase∶ conservation of a three-kinase module from yeast to human[J]. Rev Physiol, 1999, 79∶ 143-180.

[8]BOGRE L, LIGTERINK W, HEBERLE B E. Mechano sensors in plants[J]. Nature, 1996, 383∶ 489-490.

[9]ICHIMURA K, MIZOGUCHI T, YOSHIDA R, et al. Various abiotic stresses rapidly activate Arabidopsis MAK kinases AtMPK4 and AtMPK6 [J]. The Plant J, 2000, 24(5)∶ 655-666.

[10]CHENK P W, SNAAR-JAGALSKA B E. Signal perception and transduction∶ the role of protein kinases[J]. Biochim Biophys Acta, 1999, 1449∶ 1-24.

[11]曹云飛, 張海娜, 肖凱. CBF轉錄因子介導的植物低溫信號轉導研究進展[J]. 棉花學報, 2007, 19 (4)∶ 304-311.

[12]MIZOGUCHI T, IRIE K, HIRAYAMA T, et al. A gene encoding a mitogen-activated protein kinase kinase kinase is induced simultaneously with genes for a mitogen-activated protein kinase and an S6 ribosomal protein kinase by touch, cold, and water stress in Arabidopsis thaliana Proc[J]. Plant Biol, 1996, 93∶ 765-769.

[13]MIZOGUCHI T, ICHIMURA K, SHINOZAKI K. Environmental stress response in plants∶ the role of mitogen-activated protein kinases[J]. Trends Biotechnol, 1997, 15∶ 15-19.

[14]BOGRE L, CALDERINI O, BINAROVA P. A MAP kinase is activated late in plant mitosis and becomes localized to the plane of cell division [J]. Plant Cell, 1999, 11∶ 101-113.

[15]DAISUKE M, TAKASHI NI, KEN-ICHI S, et al. Activation of AtMEK1, an Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase, in vitro and in vivo∶ analysis of active mutants expressed in E. coli and generation of the active form in stress response in seedlings[J]. The Plant J, 2002, 29(5)∶637-647.

[16]TEIGE M, SCHEIKL E, EULGEM T, et al. The MKK2 pathway mediates cold and salt stress signaling in Arabidopsis[J]. Mol Cell, 2004, 15∶ 141-152.

[17]MIZOGUCHI T, ICHIMURA K, YOSHIDA R, et al. MAP kinase cascades in Arabidopsis. their roles in stress and hormone responses[C]// HIRT H. Results and problems in cell differen-tiation∶ MAP kinases in plant signal transduction. Heideberg Springer, 2000∶ 29-38.

[18]HUANG Haojen, FU Shinfeng, TAI Yinghsia, et al. Expression of Oryza sativa MAP kinase gene is developmentally regulated and stressresponsive[J]. Physiol Plant, 2002, 114∶ 572-580.

[19]FU Shinfeng, CHOU Wanchi, HUANG Dinqding, et al. Transcriptional regulation of a rice mitogen-activated protein kinase gene, OsMAPK4, in response to environmental stresses[J]. Plant Cell Physiol, 2002, 43∶958-963.

[20]XIONG Lizhong, YANG Yinong. Disease resistance and abiotic stress tolerance in rice are inversely modulated by an abscisic acid-inducible mitogen-activated protein kinase[J]. The Plant Cell, 2003, 15∶ 745-759.

[21]AGRAWAL G K, RAKWAL R, IWAHASHI H. Isolation of novel rice (Oryza sativa L.) multiple stress responsive MAP kinase gene, OsMSRMK 2, whose mRNA accumulates rapidly in response to environmental cues[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 294∶ 1009-1016.

[22]CLAUDIA J, STEFAN K, WILCO L, et al. Stress signaling in plants∶a mitogen-activated protein kinase pathway is activated by cold and drought[J]. Plant Biol, 1996, 93∶ 11274-11279.

[23]WANG Meimei, ZHANG Ying, WANG Jian, et al. A novel MAP kinase gene in cotton (Gossypium hirsutum L.), GhMAPK, is involved in response to diverse environmental stresses[J]. J Biochem Mol Biol, 2007, 40(3)∶ 325-332.

[24]HARDIN S C, WOLNIAK S M. Molecular cloning and characterization of maize ZmMEK1, a protein kinase with a catalytic domain homologous to mitogen-and stress-activated protein kinase kinases[J]. Planta, 1998, 206∶ 577-584.

[25]BERBERICH T, SANO H, KUSANO T. Involvement of a MAP kinase, ZmMPK5, in senescence and recovery from low-temperature stress in maize[J]. Mol Gen Genet, 1999, 262∶ 534-542.

[26]馮雙慶, YAO Y T, BUCHAMAN S J, et al. 冷害溫度下番茄氨基酸含量的變化[J]. 園藝學報, 1995, 22(1)∶ 95-96.

[27]生吉萍, 羅云波, 申琳. 轉反義ACC合成酶基因番茄與普通番茄果實植物內源激素含量的變化[J]. 中國農業科學, 2000, 33(3)∶ 43-48.

[28]STULEMEIJER I J E, STRATMANN J W, JOOSTEN M H A J. Tomato mitogen-activated protein kinases LeMPK1, LeMPK2, and LeMPK3 are activated during the Cf-4/Avr4-induced hypersensitive response and have distinct phosphorylation specificities[J]. Plant Physiol, 2007, 144∶ 1481-1494.

MAPK Response under Low-temperature Stress and Bioinformatic Prediction of LeMAPK Functions

DING Yang1，ZHAO Rui-rui1，SHEN Lin1,2，SHENG Ji-ping1,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；2. College of Food Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China)

Mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade is an important pathway of signal transduction in plants to response the changes from external environment. MAPK cascade is involved in the process of low-temperature signal transduction and plays a dominant role in the amplification and transmission of signals. Currently, different MAPKs are discovered to be involved in low-temperature stress in plants. Research progress of MAPK was discussed in this article. Bioinformatic methods were also applied to predict relative functions of LeMAPKs in tomato. Therefore, this article provided the theoretical basis for further investigation on MAPK cascade mechanisms of signal transduction at low temperature.

plant；low-temperature；stress；MAPK

Q814

A

1002-6630(2010)09-0292-05

2009-10-10

國家自然科學基金項目(30571296；30671471)

丁洋(1983—)，女，博士研究生，主要從事采后生理與生物技術研究。E-mail：dingyang1023@126.com

*通信作者：生吉萍(1967—)，女，副教授，博士，主要從事果蔬采后生理與生物技術研究。E-mail： pingshen@cau.edu.cn