柑橘皮精油成分分析及抑菌活性研究

陳林林，米 強，辛嘉英,3

(1. 哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2. 黑龍江省綠色食品發展中心，黑龍江 哈爾濱 150066；3. 中國科學院蘭州化學物理研究所 羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

柑橘皮精油成分分析及抑菌活性研究

陳林林1，米 強2，辛嘉英1,3

(1. 哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2. 黑龍江省綠色食品發展中心，黑龍江 哈爾濱 150066；3. 中國科學院蘭州化學物理研究所 羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

采用水蒸氣蒸餾法提取柑橘皮精油，通過氣相色譜-質譜法(GC-MS)對精油進行成分分析，鑒定出17種化合物，占精油的99.80%。其中主要以檸檬烯(92.72%)為主，萜類化合物的含量最高，可達97.90%。還含有少量的醛、醇和酮等化合物。通過測量柑橘皮精油的抑菌圈直徑判定其抗菌活性的大小，結果表明：柑橘皮精油對大腸桿菌、白色葡萄球菌和青霉均有較強的抑菌作用，對大腸桿菌的抑菌作用最強。對大腸桿菌和白色葡萄球菌的抑菌圈直徑均大于15mm，屬高度敏感；對青霉的抑菌圈直徑為14.1mm，屬中度敏感。大腸桿菌和白色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)分別小于1.25%和2.5%。

柑橘皮精油；氣相色譜-質譜(GC-MS)；抑菌活性

柑橘皮精油主要成分為檸檬精油(limonene) 可在常壓下被蒸餾出而不致分解[1]。新鮮的柑橘皮中含有2%～3%的精油，它是食品香精、化妝品香精和香水配料的優質原料[2-3]。食用香料植物提取物精油中含有多種低分子的抗菌物質和抗氧化成分，作為果蔬類天然保鮮劑，能有效地抑菌防腐。這些低分子的抗菌物質，如肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、桂醛、香茅醇、百里酚、丁香酚等，可抵抗大量的細菌、霉菌和酵母菌[4-5]。莫小路[6]等研究了作用濃度為0.7～4.0μL/mL的南方藥用植物香芋、廣藿香、大葉胺和蛇床的精油對6種植物病原真菌的抑制活性。結果表明，大葉胺、廣藿香和香芋精油對串珠鐮刀病毒、玉米彎孢霉菌等多種供試植物病原真菌的生長有明顯抑制作用。不同的精油對各病原真菌的抑制率有一定差異。目前我國的柑橘皮精油基本靠進口，提取柑橘皮精油常用的方法有壓榨法、溶劑浸提法和水蒸氣蒸餾法以及超臨界二氧化碳萃取技術[7]。本

研究將利用水蒸氣蒸餾法提取橘皮精油，應用氣相色譜-質譜(GC-MS)法分析其化學成分，通過濾紙片法測量柑橘皮精油對大腸桿菌、白色葡萄球菌和青霉的最大抑菌圈的直徑，分析柑橘精油的抑菌作用，并確定出最低抑菌濃度。為自然資源柑橘生產加工中的副產物的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichia coli)、白色葡萄球菌(Staphylococcus cremoris)、青霉(Penicillium sp.)由哈爾濱商業大學微生物實驗室提供。

柑橘、馬鈴薯購自哈爾濱民安市場。

氯化鈉(分析純) 哈爾濱新春化工廠；無水硫酸鈉(分析純) 哈爾濱市東方化學研究所；乙醚(分析純) 金陵石化開發公司；蛋白胨、牛肉膏粉、瓊脂、葡萄糖(生物試劑) 哈爾濱市鴻輝生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FZ102型植物粉碎機 中國天津市泰斯特儀器有限公司；G238型電子分析天平 中國上海醫用激光儀器廠；DHG-920A型電熱恒溫鼓風干燥機 中國上海精密實驗設備有限公司；PC-1000數顯示恒溫水浴鍋 中國上海精密儀器儀表有限公司；R-201旋轉蒸發儀 中國上海申勝生物技術有限公司；GC6890-MSD5973型氣相色譜質譜聯用儀 美國Agilent公司；YX-400B型滅菌鍋 中國上海三申醫療器械有限公司；SW-CT-2FD型超凈工作臺 中國蘇州凈化設備有限公司；SPX-150B-Z生化培養箱 中國上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 柑橘皮精油的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取[8]。準確稱取5.0g新鮮破碎的柑橘皮，浸泡2h，加入一定量的蒸餾水，蒸餾4h后，收集提取液，向提取液中加入30g/L NaCl，靜置一段時間后，用無水乙醚萃取兩次，分出醚層，加入無水硫酸鈉進行干燥除去水分和精油中殘存的溶劑，得到柑橘皮精油，橘皮精油的得率可達3.4%。

1.3.2 GC-MS測定條件

色譜條件[9-11]：色譜柱：HP-5MS(30m×0.25mm，0.25μm)。初始溫度為60℃，停留1min，以6℃/min的速率升至150℃。載氣為氦氣，流速1.0mL/min，進樣口溫度250℃；分流比100:1，進樣量0.1μL。

質譜條件：EI電子源，離子源溫度230℃，電子能量70eV；質量掃描范圍：30～600u，檢索譜庫：NIST05，Wiley。

1.3.3 柑橘皮精油抑菌實驗

1.3.3.1 培養基的制備

分別配制牛肉膏蛋白胨培養基、土豆培養基，待用[12]。

1.3.3.2 菌懸液的制備

將各菌種活化，制成菌懸液。細菌使用平板計數法，霉菌使用顯微鏡直接記數法測菌體個數，調至濃度為含菌體106～107個/mL 的菌懸液，備用[13-14]。

1.3.3.3 濾紙片擴散法測定抑菌圈

將各種待測菌懸液各取0.10mL 均勻涂布于相應的固體培養基表面，制成含菌平板。將平板用彩筆平均劃分為4個區域，用滅菌后直徑為5.5mm的圓形濾紙片蘸取體積分數為100%柑橘皮精油分別輕輕地貼于其中的兩個區域，另兩個區域作為對照，細菌置培養箱中37℃下培養24h，霉菌于培養箱中28℃下培養48h。每種菌做3 個平行，選取抑菌圈比較明顯的平板測定抑菌圈直徑，結果取3次重復實驗的平均值[15-17]。

1.3.3.4 最低抑菌濃度(MIC)的測定

配制牛肉膏蛋白胨培養基，傾注于平板內，冷卻后移取0.1mL大腸桿菌菌液、白色葡萄球菌菌液均勻涂布于培養基表面，將平板用彩筆平均劃分為4個區域，用圓形濾紙片分別蘸取體積分數為5%、2.5%、1.25%、0.83%的柑橘皮精油輕輕地貼于4個區域內，培養24h。將上述平板繼續培養24h，以最小抑菌圈直徑對應的體積分數作為該菌種的MIC[18]。

2 結果與分析

2.1 柑橘皮精油成分分析

柑橘皮精油的總離子流圖見圖1，共檢出18種成分。利用峰面積歸一化法列出其中各組分及相對含量，所得結果見表1。

圖1 柑橘皮精油的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the essential oil from citrus peel

由表1可知，解析出18種物質，鑒定出已知化合物17種，占精油的99.80%，其中相對百分含量最高的組分為檸檬烯(92.72%)，為柑橘皮精油的主要芳香成

分。萜類化合物的含量最高(97.90%)。此外，在柑橘皮精油中還含有少量的醛(0.30%)、醇(1.11%)和酮(0.27%)等化合物。

表1 柑橘皮精油成分分析表Table 1 Composition analysis of the essential oil from citrus peel

2.2 精油抑菌實驗結果

2.2.1 抑菌圈的大小

通過測定柑橘皮精油對大腸桿菌、白色葡萄球菌和青霉的的抑菌圈直徑大小，比較精油對這3種菌的抑菌效果，結果見表2。

表2 柑橘皮精油對供試菌的抑菌圈直徑Table 2 Inhibition zone diameters of the essential oil from citrus peel against tested microbes mm

抗菌素抑菌圈實驗結果的判定標準是：抑菌圈直徑大于15mm時為高度敏感、10～15mm時為中度敏感，7～9mm時為低度敏感、無抑菌圈者為不敏感[19]。由表2可知，柑橘皮精油對供試的3種細菌均有較強的抑制效果，對大腸桿菌和白色葡萄球菌的抑菌圈直徑均大于15mm，屬高度敏感；對青霉的抑菌圈直徑為14.1mm，屬中度敏感，對大腸桿菌的抑制作用最強。說明柑橘皮精油對兩種細菌的抑制作用要好于對霉菌的抑菌作用。

2.2.2 最低抑菌濃度(MIC)的確定

對大腸桿菌和白色葡萄球菌最低抑菌濃度的確定如圖2、3。

圖2 柑橘皮精油對大腸桿菌的最低抑菌濃度Fig.2 MIC of the essential oil from citrus peel against Escherichia coli

由圖2可知，當柑橘皮精油體積分數為0.83%時，濾紙片周圍已無抑菌圈產生，而當體積分數為1.25%時，濾紙片周圍產生抑菌圈，因此認為，大腸桿菌的最低抑菌濃度介于精油體積分數為0.83%與1.25%之間，同時也是其最低殺菌濃度。

圖3 柑橘皮精油對白色葡萄球菌的最低抑菌濃度Fig.3 MIC of the essential oil from citrus peel against Staphylococcus cremoris

由圖3可知，隨著柑橘皮精油體積分數增加，抑菌圈的直徑也逐漸增大，1.25%的柑橘皮精油已不能產生抑菌圈，當體積分數達到2.5%時開始出現抑菌圈。因此柑橘皮精油對白色葡萄球菌的最低抑菌濃度介于1.25%與2.5%之間。

3 結 論

利用水蒸氣蒸餾法獲得柑橘皮精油。通過GC-MS對精油進行分析，鑒定出17個成分，占精油99.80%。主要芳香成分為檸檬烯(92.72%)，萜類化合物的含量最高。柑橘皮精油對大腸桿菌、白色葡萄球菌和青霉均有抑菌性且具有廣譜性，推測其對大部分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均可能有抑菌作用。對大腸桿菌的抑菌性最強，其次為白色葡萄球菌，對青霉抑菌效果較弱，對大腸桿菌和白色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別介于

0.83%～1.25%和1.25%～2.5%之間。此外，為了使柑橘皮精油成分能更有效應用于食品中，有必要建立適用的關鍵控制評價方法，綜合食品的抗菌效果和精油對食品感官影響，優化添加配方，結合保藏措施，使其更具實際應用性。

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Composition Analysis and Antibacterial Activity of the Essential Oil from Citrus Peel

CHEN Lin-lin1，MI Qiang2，XIN Jia-ying1,3
(1. Department of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；2. Green Food Development Center of Heilongjiang Province, Harbin 150066, China；3. State Key Laboratory for Oxo Synthesis and Selective Oxidation, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China)

Citrus peel essential oil was obtained by distillation and its composition was analyzed by gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS). Totally 17 compounds were identified and represented 99.80% of the essential oil, including D-limonene (92.72%), the most predominant compound, terpenoids having the highest relative content (97.90%) and small amounts of aldehyde, alcohol and ketone compounds. The antibacterial activity of the essential oil was determined by measuring inhibition zone diameter, and the results showed that it had stronger inhibitory effect against Escherichia coli, Staphylococcus cremoris and Penicillium sp., especially against Escherichia coli. The inhibition zone diameters against Escherichia coli and Staphylococcus cremoris were both larger than 15 mm, indicating high sensitivity, and that against Penicillium sp. 14.1 mm, moderate sensitivity. The minimum inhibitory concentrations (MICs) against Escherichia coli and Staphylococcus cremoris were 1.25% and 2.5%, respectively.

citrus peel essential oil；gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS)；antibacterial activity

TS209

A

1002-6630(2010)17-0025-04

2010-01-25

國家自然科學基金項目(20873034)；教育部新世紀優秀人才支持計劃項目(NCET-05-0356)

陳林林(1979—)，女，講師，博士，研究方向為食品科學。E-mail：linclear1207@yahoo.com.cn