雪蓮果體外抗氧化和自由基清除能力

楊少輝，宋英今，王潔華，季 靜

(天津大學農業與生物工程學院，天津 300072)

雪蓮果體外抗氧化和自由基清除能力

楊少輝，宋英今，王潔華，季 靜

(天津大學農業與生物工程學院，天津 300072)

抗氧化能力是衡量果蔬營養及保健價值的重要指標之一。雪蓮果是一種藥食兩用植物，對多種慢性疾病有緩解作用。分別采用5種方法(DPPH、ABTS、FRAP、SASR和MCC)對雪蓮果塊根甲醇提取液的自由基清除能力及抗氧化活性進行體外評價。結果表明：DPPH法測定的Trolox當量抗氧化能力(TEAC)為410.263mg Trolox/g md，抗壞血酸當量抗氧化能力(AEAC)為230.485mg VC/g md，IC50值為1.464mg/mL；ABTS法測定的TEAC為267.584mg Trolox/g md，AEAC為41.597mg VC/g md，IC50值為1.269mg/mL；SRSA法測定的TEAC為652.816mg Trolox/g md，AEAC為101.451mg VC/g md，IC50值為7.720mg/mL。說明雪蓮果塊根提取物對DPPH自由基、ABTS+·和O2·三種不同的自由基均有一定的清除活性。此外，雪蓮果塊根提取物還具有較高的總抗氧化(FRAP值為131.723 mg FeSO4/g md)和較強的金屬螯合能力(73.193%)。

雪蓮果；塊根；抗氧化；自由基

近年來，食品學家及營養學家一致認為，我們日常攝入的果蔬有利于降低某些疾病發生的可能，包括癌癥及心腦血管疾病[1-2]。這些有益的作用被認為來源于果蔬中的多種抗氧化物質[3-5]，其中包括多酚、抗壞血酸、類胡蘿卜素以及生育酚等。它們能夠以抑制引發反應和破壞鏈鎖反應的方式清除自由基，還能以螯合金屬離子、消除過氧化氫以及清除超氧負離子和單態氧的方式抑制自由基的形成[6]。所以，抗氧化劑在預防上述疾病方面扮演著重要的角色，而果蔬正是人類攝取抗氧化物質最主要的來源。

雪蓮果(SmaIlanthus sonchifolius，yacon)，菊科塊根作物，生熟皆可食用，是安第斯山脈高山地區印第安人的傳統食品，被認為是可緩解糖尿病、腸道功能紊亂等多種慢性疾病的藥食兩用植物[7]。目前，在我國云南及其他部分地區已有大面積種植。隨著人們對功能性食品需求的日益增加，雪蓮果因其特殊的功能特性和良好的藥用價值越來越被重視。目前，國內外對雪蓮果塊根抗氧化活性的研究很少，尤其是對各種自由基

清除能力的系統研究還未見報道。為此，本實驗擬通過DPPH自由基清除能力測定法、ABTS+·清除能力測定法、鐵離子還原/總抗氧化能力測定(ferric reducing antioxidant power，FRAP)法、超氧陰離子自由基清除能力(superoxide radical scavenging activity，SRSA)法和金屬離子螯合能力(metal chelating capacity，MCC)法，共5種方法對雪蓮果的抗氧化活性及自由基清除能力進行綜合分析，以期為雪蓮果保健產品的開發提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮雪蓮果塊根購于天津市水果批發市場(來源于昆明嵩明縣)，置于－72℃備用。

1,1-二苯-1-苦基苯肼自由基(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH)、Fe3+-三吡啶三吖嗪(tripyridyltriazine，TPTZ)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox，水溶性VE)、還原型輔酶I(nicotineamide adenine dinucleotide，NADH)、吩嗪硫酸甲醋(phenazine methosulphate，PMS)、2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2-azino-bis-(3-ethylbmzothiazoline-sulfonic ac，ABTS)、抗壞血酸(VC) Sigma公司；所有藥品均為分析純。

UVProbe 2550紫外分光光度計 日本Shimadzu公司；FD-1冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 樣品制備

新鮮雪蓮果塊根液氮研磨后冷凍干燥至恒質量，粉碎后過70目篩，于4℃避光保存備用。取1.0g上述樣品(干質量，md)用10mL 60%甲醇在50℃提取5h，提取液用濾紙過濾，對濾渣重復使用相同的條件再次提取，兩次的濾液合并，然后儲存在4℃以供分析。

1.3 DPPH法測定抗氧化能力[8-9]

不同質量濃度(1、2.5、5g/100mL)的雪蓮果樣品液0.1mL分別加入2mL 6.25×10-5mol/L DPPH甲醇溶液中，暗處30min，以甲醇溶劑做空白對照，測量其在波長517nm處的吸光度(Ai)。測定2mL DPPH 甲醇溶液與0.1mL甲醇混合后在波長517nm 處的吸光度(A0)；測定2mL甲醇溶液與0.1mL樣品液在波長517nm 處的吸光度(Aj)。按(1)式計算自由基清除率。

另以不同濃度(0、250、500、1000、1500、2000 mmol/L)的Trolox和VC清除DPPH自由基的能力做標準曲線，計算雪蓮果的Trolox和VC當量抗氧化能力TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity)和AEAC(ascorbic acid equivalent antioxidant capacity)。

1.4 自由基陽離子(ABTS+·)法測定抗氧化能力[10-11]

將等量的7mmol/L ABTS溶液與2.45mmol/L過硫酸鉀混合使之反應并置于暗處12～16h以制備ABTS+·。用甲醇將ABTS+·溶液稀釋直至其在波長734nm處吸光度為0.70 ± 0.02。將25μL不同質量濃度(1、2.5、5g/100mL)樣品液加入2mL ABTS+·溶液中以稀釋，6min后測量其在波長734nm處的吸光度(Ai)。測定2mL ABTS+·溶液與25 μL甲醇混合后在波長517nm處的吸光度(A0)；測定2mL甲醇溶液與25 μL樣品液在波長517nm處的吸光度(Aj)。按(2)式計算自由基清除率。

另以不同濃度(0、100、200、400、600、800、1000mmol/L)的Trolox和VC清除自由基的能力做標準曲線，計算雪蓮果的Trolox和VC當量抗氧化能力TEAC和AEAC。

1.5 以超氧陰離子自由基清除能力法(SRSA)測定抗氧化能力[12]

50μL不同質量濃度(1、2.5、5g/100mL)的樣品提取液中加入1mL 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)以及150 μmol/L的NBT、60μmol/L的PMS和468μmol/L的NADH。置于25℃條件下8min，測量其在波長560nm處的吸光度(Ai)。測定1mL 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液與50μL甲醇混合后在波長517nm 處的吸光度(A0)；測定1mL 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液與50μL樣品液在波長517nm處的吸光度(Aj)。按(3)式計算自由基清除率。

另以不同濃度(0、250、500、1000、1500、2000 mmol/L)的Trolox和VC清除自由基的能力做標準曲線，計算雪蓮果的Trolox和VC當量抗氧化能力TEAC和AEAC。

1.6 鐵離子還原／抗氧化能力測定(FRAP)[13]

取0.1mL 不同質量濃度(0.5、0.75、1.0g/100mL)的樣品溶液，加入1.8mL TPTZ工作液(由0.3mol/L醋酸鹽緩沖液25mL，10mmol/L TPTZ溶液2.5mL，20mmol/L FeCl3溶液2.5mL組成)，25℃反應8min，波長593nm處測定吸光度。

另以不同濃度(0、100、200、400、800、1200、2000mmol/L)的FeSO4做標準曲線。樣品抗氧化活性(FRAP值)以每克干質量達到同樣吸光度所需的FeSO4毫摩爾數表示(mmol FeSO4/g md)。

1.7 以金屬螯合能力法(MCC)測定抗氧化能力[10,14]

將1mL的提取液加入2.8mL蒸餾水中，再與50μL的

2mmol/L的FeCl2· 4H2O和150 μL的5mmol/L Ferrozine，振蕩混合。10min后，在波長562nm處測量亞鐵離子-Ferrozine聯合體的生成量以確定Fe2+的量。同時以0.1mg/mL EDTA做對照。金屬螯合活性按(4)式計算。

2 結果與分析

2.1 雪蓮果塊根提取液清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基是穩定的紫色自由基，在517nm處有最大吸收波長。當有自由基清除劑存在時，DPPH自由基的單電子由于被配對，DPPH自由基濃度減小而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度值變小，且顏色變化與配對電子數成化學計量關系。由于這種方法簡便、靈敏可靠，所以在國內外廣泛用于清除自由基物質性質的研究與天然抗氧化劑的篩選。為了更準確地評價樣品間的抗氧化活性，常用清除率50%自由基時的溶液質量濃度IC50來比較，較低的IC50值表示較高的自由基清除能力。

表1 雪蓮果塊根的DPPH自由基清除能力(x±s)Table 1 DPPH radical scavenging activity of yacon tubers (x±s)

雪蓮果塊根提取液的DPPH自由基清除能力測定結果如表1所示，并以常用的抗氧化劑Trolox和抗壞血酸作為對照。從表1可以看出，每克干質量的雪蓮果塊根相當于410.263mg Trolox (1.639mmol Trolox)，相當于230.485mg VC (1.306mmol VC)，IC50為1.464mg/mL，這組數據雖然低于人工合成的常用抗氧化劑Trolox和VC，但仍然表現出較高的自由基清除能力。

2.2 雪蓮果塊根提取液清除ABTS+·的能力

ABTS+·為一穩定的有機自由基，試樣抗氧化能力越強，其提供電子的能力也就越強，與該有機自由基反應量越大，反應速率也越快，通過測定反應液吸光度的變化，直接反應出樣品抗氧化能力的大小。本實驗測定了雪蓮果塊根提取液、Trolox和VC對ABTS+·的清除率(表2)，結果表明，與兩種常用人工抗氧化劑相比，雪蓮果塊根提取液的TEAC、AEAC和IC50雖然較低，分別為267.584mg Trolox/g md、41.597mg VC/g md和1.269mg/mL，但對ABTS+·仍有一定的清除作用。

表2 雪蓮果塊根的ABTS+·清除能力(x±s)Table 2 ABTS+· radical scavenging activity of yacon tubers (x±s)

2.3 雪蓮果塊根提取液清除超氧陰離子自由基的能力

超氧陰離子自由基(O2·)是生物體內所有氧自由基中的第一個自由基，可以經過一系列反應生成其他的氧自由基，引起脂質過氧化，導致細胞膜結構和功能的改變。利用PMS及NADH作用產生超氧陰離子，而超氧陰離子會進一步將NBT還原成diformazan，此化合物在波長560nm處具有強吸光度，藉此吸光度值可以判定樣品清除超氧陰離子的能力。利用此方法測定雪蓮果塊根甲醇提取物對超氧陰離子清除能力(表3)，結果表明，雪蓮果塊根提取物的TEAC值為652.816mg Trolox/g (2.608mmol Trolox/g)、AEAC值為101.451mg VC/g (0.576mmol VC/g)、IC50為7.720mg/mL，對O2·的清除能力雖然低于人工抗氧化劑Trolox和VC，但仍然表現出較高的自由基清除能力。

表3 雪蓮果塊根的O2·清除能力(x±s)Table 3 Superoxide anion radical scavenging activity of yacon tubers (x±s)

2.4 雪蓮果塊根提取液的FRAP抗氧化能力

抗氧化物質將Fe3+還原為Fe2+，Fe2+與TPTZ結合生成藍色絡合物，在波長593nm處有最大光吸收。吸光度越大，表明抗氧化劑有越強的還原能力，因而具有越高的抗氧化活性。由于FRAP法不是針對某一種自由基清除能力，而是樣品總的還原能力，因此可用來反映樣品總的抗氧化活性[15]。

表4 雪蓮果塊根鐵離子還原／抗氧化能力及金屬螯合能力測定Table 4 FRAP and ferrous ions chelating capacity of yacon tubers

從表4可以看出，每克干質量的雪蓮果塊根相當于131.723mg FeSO4(0.867mmol FeSO4)，即雪蓮果塊根提取液將13.17%的Fe3+還原為了Fe2+，說明雪蓮果塊根提取液具有較高的總抗氧化能力。

2.5 雪蓮果塊根提取液的金屬螯合能力

金屬離子(如鐵、銅)在自由基氧化過程中起催化劑作用，金屬離子螯合可以大大的降低金屬離子的催化作用，避免自由基生成。因此，對金屬螯合力大小的測定也是評價樣品抗氧化性能常用的方法。Ferrozine能夠與Fe2+形成紫紅色的螯合物，當其他有競爭力的螯合劑存在時，紫紅色會變淺。因此，通過螯合物顏色的變化，可以評價物質對Fe2+的螯合能力。表4所示的結果表明，EDTA表現出極強的金屬螯合活性，在質量濃度為0.1mg/mL時就已達到94.31%的螯合率，雪蓮果塊根提取液也具有很強的螯合作用，0.1g/mL雪蓮果塊根提取液對Fe2+的螯合率為73.193%，相當于EDTA的77.61%，說明雪蓮果塊根的抗氧化能力很大程度上來自于它的金屬螯合能力。

3 討 論

DPPH、ABTS和SRSA這3種方法都是基于分光光度法，通過測定樣品清除自由基的能力而表征抗氧化能力，然而這3種方法的反應機制和反應條件不同。FRAP方法反映樣品還原Fe3+的能力，MCC法則測定樣品螯合Fe2+的能力。因此在測定樣品的抗氧化活性時，可以根據需要采用多種方法來綜合評價樣品的抗氧化活性及自由基的清除能力。

植物的抗氧化能力與其多酚類、黃酮類、VC、VE和類胡蘿卜素等物質含量有一定的相關性[3]。很多資料表明，提取溶劑會顯著影響植物提取物中抗氧化成分的產量和抗氧化能力。植物可溶性酚類物質主要分布在液泡中，而類黃酮類和不溶性多酚類物質主要沉積在細胞壁上并與蛋白質、多糖以氫鍵、疏水鍵相結合。水及低濃度甲醇、乙醇可以自由進出細胞，高濃度甲醇、乙醇可能會引起組織中蛋白質的變性，從而影響提取率。甲醇和乙醇相比，有較高的極性，且甲醇較低的分子質量更易進入細胞壁內[16]。因此，本實驗選用60%甲醇作為提取溶劑，以期提取到更多的抗氧化物質。但鑒于工業生產中大量使用甲醇的有害性，筆者正在進一步探討用乙醇作為提取溶劑的最佳提取工藝。

考察了雪蓮果塊根甲醇提取液的體外抗氧化能力，在清除DPPH自由基能力、清除ABTS+·、對O2·的清除能力、鐵離子還原／抗氧化能力測定，以及對金屬離子的螯合能力測定中均表現出較好的抗氧化活性。但其抗氧化成分未知，有待進一步以柱層析分離法、高效液相制備色譜法(HPLC)及超臨界CO2萃取等方法進行分離純化，再以紫外光譜、紅外光譜、質譜和核磁共振分析對活性成分進行結構鑒定[17]。有研究表明雪蓮果葉片中富含硒和多糖、酚酸、黃酮類等功能性成分[18-19]，雪蓮果塊根中抗氧化功能成分的相關研究還未見報道，本實驗室有關此方面的工作正在進一步展開。

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in vitro Antioxidant and Free Radical Scavenging Activities of Yacon (Smallanthus sonchifolius) Tubers

YANG Shao-hui，SONG Ying-jin，WANG Jie-hua，JI Jing
(School of Agriculture and Bioengineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

Antioxidant capacity is an important factor indicating nutritional and health value of fruits and vegetables. Yacon is a both edible and medicinal plant, which has some preventing roles for a number of chronic diseases. In this study, to assess the in vitro antioxidant potential of yacon tubers, the 60% methanol extract from yacon tubers was tested for its scavenging capacities against DPPH, ABTS+·, superoxide anion radicals, ferric reducing antioxidant power and ferrous ions chelating capacity. The DPPH radical scavenging assay of the extract showed a trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) of 410.263 mg Trolox /g md, a ascorbic acid equivalent antioxidant capacity (AEAC) of 230.485 mg VC/g mdand a median inhibition concentration (IC50) of 1.464 mg/mL, and the ABTS+· radical scavenging assay showed a TEAC of 267.584 mg Trolox/g md, an AEAC of 41.597 mg VC/g md and an IC50 of 1.269 mg/mL, and the TEAC, AEAC and IC50 obtained in the superoxide anion radical assay were 652.816 mg Trolox/g md, 101.451 mg VC/g mdand 7.720 mg/mL, respectively. These results demonstrate that the extract from yacon tubers has scavenging effect against all DPPH, ABTS+·, superoxide anion radicals. Moreover, the extract also presented high ferric reducing antioxidant power (131.723 mg FeSO4/g md) and strong ferrous ions chelating capacity (73.193%).

yacon；tuber；antioxidant activity；radical

TS255.2

A

1002-6630(2010)17-0166-04

2010-06-30

教育部新教師基金資助項目(20090032120071)

楊少輝(1977—)，女，講師，博士，研究方向為植物生物技術。E-mail：shaohuiyang77@tju.edu.cn