雅致放射毛霉固態發酵法生產菜籽肽工藝條件研究

周建新，張 弘，何 榮，王 璐，鞠興榮，袁 建

(南京財經大學 江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210003)

雅致放射毛霉固態發酵法生產菜籽肽工藝條件研究

周建新，張 弘，何 榮，王 璐，鞠興榮，袁 建

(南京財經大學 江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210003)

以肽得率、氮溶解指數和氨基酸態氮為指標，通過單因素試驗研究工藝條件對雅致放射毛霉固態發酵菜籽粕生產菜籽肽的影響。結果表明：在菜籽粕顆粒直徑為0.18～0.28mm，培養基中菜籽粕與發酵劑之比為1:1 (m/V)，葡萄糖添加量為3%，KH2PO4添加量為0.5%，pH值為9.0，發酵溫度為30℃，發酵時間為96h時，發酵指標最好。

雅致放射毛霉；固態發酵；菜籽肽；工藝條件；肽得率；氮溶解指數；氨基酸態氮

我國油菜籽年產量達1200萬t，這些油菜籽加工成油后可得到700多萬t菜籽粕[1]，相當于300多萬t粗蛋白。而由菜籽蛋白水解得到的菜籽肽，其加工特性如溶解性、乳化性、持水性等均有明顯提高[2]，同時具有抗氧化、降血壓、抗腫瘤和促進動物細胞生長等生物學活性[3-5]，其應用前景非常廣闊，市場潛力巨大。

目前國內外有關菜籽肽制備方法的研究主要是酶水解法[6]，該法需要先從菜籽粕中提取蛋白后再進行酶水解，從而使工藝復雜，生產成本高。固態發酵法主要是在幾乎沒有游離水的濕固體材料上培養微生物的工藝過程，具有投資少，能耗低，技術較簡單；產物的產率較高；基質含水量低，可大大減少生物反應器的體積，不需要廢水處理，環境污染較少，后處理加工方便等優點。雅致放射毛霉是傳統發酵豆制品的常用發酵菌種，具有很強的分解蛋白質能力[7]。本實驗在對該菌固態發酵生產菜籽肽初步研究的基礎上[8]，探討固態發酵法生產菜籽肽的工藝條件，以期為進一步優化菜籽肽生產工藝條件提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

菜籽粕(品種canola)：菜籽經礱谷機進行脫殼后粉碎，再用索氏抽提法進行脫油處理即得到實驗用菜籽粕。

1.2 菌種

雅致放射毛霉40252(Actinomucor elegans)由中國工業微生物菌種保藏中心提供。

1.3 儀器與設備

YXQ.SG41.280型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫用核子儀器有限公司；SW-CJ-1型超凈工作臺 江蘇蘇凈集團安泰公司；PHS-3C型精密數顯pH計、722N型紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器廠；GL-20B型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；PQX型多段可編程人工氣候箱 寧波東南儀器有限公司。

1.4 方法

稱取10g菜籽粕，裝入150mL錐形瓶中，滅菌(121℃、30min)，冷卻，按質量分數接入發酵劑(將活化后的斜面菌種接種于PDA平板培養基中，28℃恒溫培養箱中培養后，用無菌水洗滌霉菌孢子，調節為每mL液體種子中有4×107個孢子[9]。無菌水中事先加入葡萄糖和KH2PO4，調節pH值，即得發酵劑)，28℃恒溫培養(定時翻動通氣)，發酵后的固態基質，加蒸餾水定容至150mL，攪拌30min，4500r/min離心20min，用0.45μm微孔濾膜過濾上清液，去除不溶物和細菌后測定指標。

通過單因素試驗，研究菜籽粕顆粒直徑、培養基料液比(菜籽粕:發酵劑)、發酵劑中KH2PO4與葡萄糖的添加量(分別以培養基為基準，按質量分數添加)、初始pH值、發酵溫度與時間對氮溶解指數、氨基酸態氮和肽得率的影響。

1.5 發酵指標測定

氮溶解指數：凱氏定氮法[10]；氨基酸態氮：甲醛滴定法[11]；肽得率：雙縮脲比色法[12]。

2 結果與分析

2.1 不同菜籽粕顆粒直徑對發酵指標的影響

培養基中料液比(菜籽粕:發酵劑)為1:1(m/V)，發酵劑加入KH2PO40.3%、葡萄糖3%，起始pH6.0，28℃發酵72h，考察菜籽粕的不同顆粒直徑對發酵指標的影響，結果見圖1。

圖1 菜籽粕顆粒直徑對發酵指標的影響Fig.1 Effect of rapeseed meal granular diameter on fermentation indexes

由圖1可知，隨著菜籽粕顆粒直徑的增大，3個指標均呈現先增加后下降的態勢。當顆粒直徑在0.18～0.28mm時，3個指標均達到最大值。固態發酵底物顆粒的大小直接影響到單位體積反應表面積，也會影響顆粒間菌體的生長、氧的供給率及二氧化碳的移出率等。一般來講，小的底物顆粒可以提供較大微生物攻擊表面積，可以明顯提高固態發酵反應速率，被認為是理想的選擇。但是，在許多情況下太小的顆粒容易造成底物積團，顆粒間空隙率也減小，導致阻力增大，對傳熱、傳質產生不利影響，以致于妨礙微生物的呼吸或通氣，結果導致微生物不良生長[13]，因此本實驗為得到最佳的發酵效果選用基質顆粒直徑為0.18～0.28mm。

2.2 培養基不同料液比對發酵指標的影響

用顆粒直徑0.18～0.28mm菜籽粕配制培養基，發酵劑中加入KH2PO40.3%，葡萄糖3%，起始pH值為6.0，28℃發酵72h，考察培養基中不同料液比對發酵指標的影響，結果見圖2。

圖2 培養基料液比對發酵指標的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on fermentation indexes

由圖2可知，3個指標都是在培養基中料液比為1:1時達到峰值。培養基含水量對微生物的生長及代謝能力產生重要影響。含水量過低，造成基質膨脹程度低，物料較干燥，微生物難以生長，產酶量降低。含水量過高，減少了基質內氣體體積和氣體交換，也不利于菌種的生長[14-15]。

2.3 培養基中不同葡萄糖添加量對發酵指標的影響

圖3 葡萄糖添加量對發酵指標的影響Fig.3 Effect of glucose amount on fermentation indexes

用顆粒直徑0.18～0.28mm菜籽粕，發酵劑中加入KH2PO40.3%，培養基料液比為1:1，起始pH6.0，28℃發酵72h，考察不同葡萄糖添加量對發酵指標的影響，結果見圖3。

由圖3可知，肽得率、氨基酸態氮和氮溶解指數都呈現升高后降低趨勢，3個指標變化趨勢相對比較同步。肽得率和氨基酸態氮有一定的區分度，但差別并不十分明顯，而氮溶解指數一直下降且下降幅度比較大。一定添加量的葡萄糖有利于多肽得率的提高，因為葡萄糖是一種速效碳源，在發酵中菌種需要大量碳源以維持持續生長勢頭，從而能夠大量產酶水解菜籽粕中的菜籽蛋白；但是過高的葡萄糖添加量反而降低多肽產量，原因是發酵過程中過多的葡萄糖會過分加速菌體的呼吸作用，以致培養基中的溶解氧不能滿足需要，生長和產酶受到抑制[16]。綜合考慮優化的葡萄糖添加量為3%。

2.4 培養基中不同KH2PO4添加量對發酵指標的影響

用顆粒直徑0.18～0.28mm菜籽粕，葡萄糖添加量為3%配制發酵劑，培養基料液比為1:1，起始pH6.0，28℃發酵72h，考察不同添加量的KH2PO4對發酵指標的影響，結果見圖4。

圖4 KH2PO4添加量對發酵指標的影響Fig.4 Effect of KH2PO4amount on fermentation indexes

由圖4可知，肽得率和氨基酸態氮的變化趨勢是先升后降趨勢；而氮溶解指數在KH2PO4添加量0.1%～0.3%范圍內變化不大，并隨著KH2PO4添加量(0.5%～0.9%)的增加而降低。KH2PO4除了提供微生物生長所需的礦質元素外，還可以穩定培養基的pH值，隨著鹽濃度的增加，導致發酵過程pH值變化不大，而低酸性條件雖然有利于雅致放射毛霉的生長，卻不利于其所產蛋白酶水解效果的發揮。綜合考慮較佳KH2PO4添加量為0.5%。

2.5 培養基不同pH值對發酵指標的影響

圖5 培養基pH值對發酵指標的影響Fig.5 Effect of initial pH on fermentation indexes

用顆粒直徑0.18～0.28mm菜籽粕，發酵劑中葡萄糖添加量為3%，KH2PO4添加量為0.5%，培養基料液比為1:1，28℃發酵72h，考察培養基起始不同pH值對發酵指標的影響，結果見圖5。

由圖5可知，在pH3～11范圍內，肽得率、氨基酸態氮和氮溶解指數都呈現先升高后降低趨勢，3個指標變化相對比較同步，并且在pH9時達到最大值。原因可能是雅致放射毛霉所產蛋白酶是堿性蛋白質酶[17]，同時堿性條件下菜籽蛋白更容易從菜籽粕中溶出，蛋白質水解效果相對較好。另外，過高的pH值不利于雅致放射毛霉的生長和酶解作用的發揮。綜合考慮優化pH值為9。

2.6 不同發酵時間對發酵指標的影響

用顆粒直徑0.18～0.28mm菜籽粕，培養基中葡萄糖添加量為3%，KH2PO4添加量為0.5%，培養基料液比為1:1，pH值為9，28℃發酵，考察不同發酵時間對發酵指標的影響，結果見圖6。

圖6 發酵時間對發酵指標的影響Fig.6 Effect of fermentation time on fermentation indexes

由圖6可知，隨著發酵時間的增加，肽得率是明顯的先增加后趨于穩定的態勢；氨基酸態氮和氮溶解指數則都是呈現出先增加后下降的態勢。肽得率的變化趨勢比較明顯，在發酵前96h內不斷增加，96h以后趨于穩定，在96h時達到峰值；氨基酸態氮的區分度明顯，隨著時間的增加則先增加，在48h時到達峰值，隨后劇烈下降；氮溶解指數在24h時極低，在48h達到峰值，二者差別很大，在48h以后不斷下降，但下降幅度不是很大。氮溶解指數和氨基酸態氮都是在48h時到達峰值，隨著發酵時間的延長有所降低，其原因可能是微生物生長利用了其中的無機氮。考慮到肽得率是最主要的指標，所以發酵時間定為96h。

2.7 不同發酵溫度對發酵指標的影響

用顆粒直徑0.18～0.28mm菜籽粕，發酵劑中葡萄糖添加量為3%，KH2PO4添加量為0.5%，培養基料液比為1:1，pH值為9.0，發酵時間96h，考察不同發酵溫度對發酵指標的影響，結果見圖7。

由圖7可知，溫度對于發酵指標的影響比較明顯，3個指標都是在30℃時達到最高值，所以選擇發酵溫度為30℃。

圖7 發酵溫度對發酵指標的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on fermentation indexes

3 結 論

以肽得率、氮溶解指數和氨基酸態氮為指標，研究了工藝條件對雅致放射毛霉固態發酵菜籽粕生產菜籽蛋白肽的影響。通過單因素試驗得出雅致放射毛霉發酵生產菜籽肽的工藝條件為菜籽粕顆粒直徑0.18～0.28mm，培養基中菜籽粕與發酵劑之比為1:1，培養基中添加葡萄糖3%，磷酸二氫鉀0.5%，pH值為9.0，發酵溫度為30℃，發酵時間為96h，在此條件下，發酵菜籽粕的肽得率為10.14%，氮溶解指數為80.02%，氨基酸態氮為2.16%，發酵效果較好。優化發酵條件還有待于進一步研究。

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An Investigation on Some Technological Conditions for Solid-state Fermentation by Actinomucor elegans for the Production of Rapeseed Peptides

ZHOU Jian-xin，ZHANG Hong，HE Rong，WANG Lu，JU Xing-rong，YUAN Jian
(Jiangsu Provincial Key Laboratory of Quality Control and Further Processing of Grain and Oils, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China)

The production of rapeseed peptides based on solid-state fermentation by Actinomucor elegans was investigated by one-factor-at-a-time method with respect to the effects of some technological conditions on rapeseed peptide yield, nitrogen solubility index and amino nitrogen. The optimal technological conditions were determined as follows: rapeseed meal granular diameter, 0.18 to 0.28 mm, solid-to-liquid ratio 1:1, glucose amount 3%, KH2PO4 amount 0.5%, pH 9.0, fermentation temperature 30 ℃ and fermentation time 96 h.

Actinomucor elegans；solid-state fermentation；rapeseed peptide；technological conditions；peptide yield；nitrogen solubility index；amino nitrogen

TQ936.16

A

1002-6630(2010)17-0214-04

2010-01-18

國家“863”計劃項目(2007AA10Z331)；農業部科技成果轉化資金項目(2009C10045)

周建新(1964—)，男，教授，碩士，主要從事食品發酵研究。E-mail：zhoujx1964@163.com