南美白對蝦蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物過敏原消減效果研究

王麗娟，胡志和，周 汛，陳照麗，吳海明

(1.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134；2.天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津 300134)

南美白對蝦蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物過敏原消減效果研究

王麗娟1,2，胡志和1,2，周 汛2，陳照麗2，吳海明2

(1.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134；2.天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津 300134)

采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶分解南美白對蝦的蛋白質(zhì)，以消減其中的蛋白質(zhì)過敏原；應用全身過敏反應和離體回腸平滑肌過敏性收縮實驗模型，對該工藝蛋白酶酶解產(chǎn)物的致敏性進行評價。結(jié)果顯示，3種蛋白酶的蝦蛋白酶解產(chǎn)物所致的全身過敏反應均明顯減輕(與蝦蛋白組比較，0.01＜P＜0.05或P＜0.01)；同時，3種酶解產(chǎn)物致敏的離體回腸平滑肌對蝦蛋白和酶解產(chǎn)物過敏原攻擊的反應也明顯減弱(與蝦蛋白致敏組比較，0.01＜P＜0.05或P＜0.01)。綜合評價3種酶解產(chǎn)物的致敏性，認為木瓜蛋白酶的酶解工藝較好，過敏原消減比較理想，食用更安全。

南美白對蝦；胰蛋白酶；木瓜蛋白酶；菠蘿蛋白酶；過敏實驗

近年來，食品安全問題已成為人們普遍關(guān)心的問題。其中食物過敏問題也越來越受到人們的重視，它是某些嚴重過敏性疾病發(fā)病的誘因[1]。海產(chǎn)品作為人類一種重要的食物性蛋白質(zhì)的來源，深受人們的喜愛。然而，蝦與蟹等甲殼類動物及其制品又是引起食物過敏較常見的一類食品，且多數(shù)為終生過敏[2]。因此，研究蝦過敏及蝦過敏原，探索消減蝦過敏原的工藝技術(shù)，進一步為開發(fā)低敏及脫敏的蝦類制品奠定基礎。本研究通過觀察并比較南美蝦蛋白酶解產(chǎn)物的全身性過敏反應及對豚鼠回腸平滑肌的致敏作用，以評價和比較蝦蛋白酶解工藝，尋找削減蝦蛋白過敏原的工藝技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對蝦(活) 市售。

卵白蛋白(Ⅱ型) 美國Sigma公司；南美蝦蛋白、3種蝦蛋白酶解產(chǎn)物 實驗室自制；撲爾敏(批號0903006)天津力生制藥股份有限公司。

表1 全身過敏反應致敏與激發(fā)方法Table 1 Sensitization and stimulation methods of general allergic reactions

1.2 實驗動物

英國種Hartly豚鼠，體質(zhì)量170～250g，雌雄各半，由天津市實驗動物中心提供，合格證號為SCXK津2005-0001。

1.3 儀器與設備

BL-420F生物信號采集系統(tǒng) 成都泰盟科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 南美白對蝦蛋白的制備

將南美白對蝦去殼去頭去尾去腸線后放在勻漿器中勻漿，然后加入4倍體積的冷丙酮(－20℃預冷過夜)，4℃、8000r/min離心15min，收集沉淀物，將沉淀物轉(zhuǎn)移至干凈的濾紙上，分散并讓其在室溫下空氣中風干后粉碎，之后用抽提液(1mol/L KCl、0.5mmol/L DTT(1,4-dithiothreitol，pH7.4)按1:10的比例抽提過夜，再次4℃、8000r/min離心15min，取上清，沉淀用抽提液繼續(xù)抽提4h，離心取上清。透析過夜，兩次獲得的上清液合并后冷凍干燥，于－20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 南美蝦蛋白酶解產(chǎn)物的制備

將南美蝦蛋白用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶進行分解，其酶解條件為胰蛋白酶：pH8.0，酶與底物比1:100，45℃，底物質(zhì)量濃度3g/100mL；木瓜蛋白酶：pH6.5，酶與底物比1:100，60℃，底物質(zhì)量濃度3g/100mL；菠蘿蛋白酶：pH7.5，酶與底物比1:100，55℃，底物質(zhì)量濃度5g/100mL。在酶解過程中，注意控制酶解液的pH值，酶解時間均為3h。酶解結(jié)束后，將酶解液pH值至中性，用80℃滅酶10min，冷凍干燥備用[3-4]。

1.4.3 全身過敏反應

將48只豚鼠隨機分為8組，每組6只，雌雄各半。在實驗室適應1周后進行初次致敏，激發(fā)時靜脈注射不成功者舍棄。各組的致敏與激發(fā)方法見表1。致敏期間每天兩次觀察豚鼠的反應，包括一般狀態(tài)、進食、有無過敏反應等。激發(fā)后立即觀察60min內(nèi)動物的反應，觀察指標及過敏反應評定標準見表2[5]。

表2 豚鼠過敏反應判定標準Table 2 Evaluation standards for allergic reactions in guinea pigs

1.4.4 致敏豚鼠離體回腸平滑肌過敏性收縮實驗

將豚鼠隨機分為7組，每組4～5只。各組先用卵白蛋白等致敏物質(zhì)進行致敏。致敏時進行腹腔注射，每次1.0mL/只，隔日1次，共3次。末次注射后第14天進行離體腸平滑肌過敏原攻擊實驗，取致敏豚鼠，放血處死，取出回腸一段，按離體器官裝置進行描記，浴管內(nèi)均加入30mL臺氏液。待腸收縮曲線基線穩(wěn)定后，進行過敏抗原攻擊，觀察、記錄腸收縮幅度[6]，并比較各組腸收縮變化率。

式中：F1為攻擊后的腸平滑肌收縮力/g；F0為攻擊前的腸平滑肌收縮力/g。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用方差分析和t檢驗，所有實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 全身過敏反應

按照表1的分組和表2的評判指標和評分標準，對卵白蛋白、南美蝦蛋白及其酶解產(chǎn)物各組豚鼠分別進行致敏和激發(fā)，在致敏和激發(fā)后密切觀察、記錄，并進行評分。各組動物全身過敏反應的結(jié)果見表3。

表3 動物全身過敏反應結(jié)果與評分Table 3 Results and scores of general allergic reactions in guinea pigs

由表3可以看出，南美蝦蛋白存在有明顯的過敏反應，表現(xiàn)為Ⅰ型速發(fā)型變態(tài)反應，嚴重者出現(xiàn)過敏性休克而死亡，反應與陽性對照品卵白蛋白極其相似。而蝦蛋白酶解產(chǎn)物的過敏反應則明顯減輕，不論用蝦蛋白致敏，還是用各種蝦蛋白酶解產(chǎn)物致敏，再分別用各種蝦蛋白酶解產(chǎn)物激發(fā)后的全身過敏反應發(fā)生率均明顯降低，過敏反應的表現(xiàn)均明顯減輕。

2.2 致敏豚鼠離體回腸平滑肌過敏性收縮實驗

將卵白蛋白、南美蝦蛋白以及3種蝦蛋白酶解產(chǎn)物致敏并攻擊后的離體回腸平滑肌收縮活動的變化匯總見表4。通過分析并比較各組腸平滑肌在攻擊前后收縮力的變化，評價各酶解產(chǎn)物過敏原消減的效果。

表4 卵白蛋白、南美蝦蛋白以及3種酶解產(chǎn)物的致敏作用比較Table 4 Comparison of allergic effects of egg-white protein, South American white shrimp protein and its hydrolysates prepared with three proteases

從表4及圖1中可以看出，用各蛋白酶酶解產(chǎn)物致敏后，無論用蝦蛋白過敏原攻擊還是用酶解產(chǎn)物進行攻擊，腸平滑肌的收縮均較卵白蛋白和蝦蛋白致敏組明顯減弱，而且腸平滑肌對相同濃度的撲爾敏反應也較弱，經(jīng)撲爾敏作用后，致敏的腸平滑肌對酶解產(chǎn)物的攻擊反應也減弱，說明各酶解產(chǎn)物的致敏性明顯降低。剪輯腸收縮曲線見圖1。

圖1 致敏回腸平滑肌在過敏原攻擊前后的收縮曲線Fig.1 Contraction curves of isolated ileum smooth muscle before and after allergic attack

3 討 論

近年來，國外有報道[7]稱過敏性疾病的發(fā)生呈上升趨勢，食品過敏是過敏性疾病的一種，可能成為某些嚴重過敏性疾病的誘因。國內(nèi)調(diào)查，健康人群自訴有食物過敏的占5.7%，其中皮膚點刺實驗陽性者占自訴曾患食物過敏的33.5%，占被調(diào)查人數(shù)的1.9%[8]。與成人相比，兒童食物過敏的發(fā)生率較高，重慶地區(qū)0～24個月兒童，家長自訴有食物過敏的為13.7%，被確診食物過敏的占5.7%[9]。在致敏的食物中，蝦及蟹等海鮮類食品過敏的人較多，食用蝦等海產(chǎn)品過敏引起過敏性休克的病例并非罕見[10-11]。食物過敏是一個非常復雜的反應過程，臨床數(shù)據(jù)顯示，90%以上的食物過敏屬于Ⅰ型(速發(fā)型)變態(tài)反應[12]，包括3個階段，即食物過敏原的致敏階段、激發(fā)階段和效應階段。過敏體質(zhì)的人群，食入過敏原可誘導機體產(chǎn)生IgE抗體[13]；當再次接觸該類食物，過敏原與致敏肥大細胞、嗜堿性粒細胞表面IgE抗體特異性結(jié)合，使之脫顆粒，釋放出組胺、5-羥色胺、白三烯等生物活性物質(zhì)，作用于效應組織和器官，引起局部或全身過敏反應[14]。食物過敏可以累及全身許多臟器，如口腔、消化道、呼吸道、皮膚及心血管等，引起各種臨床表現(xiàn)，如惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉，甚至出現(xiàn)呼吸困難、休克，進而危及生命[15]。因此，設法消除蝦中的過敏原，讓人們吃的安全十分必要。據(jù)文獻報道[16]，多種蛋白酶能夠?qū)讱ゎ悇游镞^敏原產(chǎn)生良好的降解作用。

該實驗工藝提取的蝦蛋白過敏原具有很強的過敏性，其過敏反應的強度或效價與卵白蛋白相近，但全身過敏反應發(fā)生的速度較卵白蛋白稍慢(與卵白蛋白比較，P＞0.05)，證明該工藝提取蝦蛋白過敏原可行。用該蝦蛋白酶解的各種產(chǎn)物的全身過敏反應及致敏的豚鼠回腸平滑肌收縮實驗中，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶解產(chǎn)物的致敏性均明顯降低，但均未能完全消除。綜合分析全身過敏反應和豚鼠回腸平滑肌收縮實驗的結(jié)果，認為木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的反應發(fā)生率較低，反應的表現(xiàn)較輕，食用的安全性較高。下一步研究將放在優(yōu)化消減過敏原的工藝上，使蝦過敏原消減效果更加理想。

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Elimination of Allergens in South American Shrimp by Protease Hydrolysis

WANG Li-juan1,2，HU Zhi-he1,2，ZHOU Xun2，CHEN Zhao-li2，WU Hai-ming2
(1. Tianjin Key Laboratory of Food Technology, Tianjin 300134, China；2. College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

In order to eliminate the allergens in South American shrimp, proteases such as trypsin, papain and bromelain were individually used to hydrolyze South American shrimp proteins. General immunity experiments in allergic guinea pigs and allergic contraction experiments of isolated ileum were used to evaluate the allergenicity of hydrolysates. The results showed that hydrolysates from South American shrimp proteins digested by each of the three proteases could result in an obvious attenuation of general allergic reactions (Compared with the group of South American shrimp protein, 0.01＜P＜0.05 or P＜0.01). Meanwhile, a reduced allergic contraction reaction of isolated ileum smooth muscle was observed in hydrolyzed South American shrimp proteins (Compared with the group of South American shrimp protein, 0.01＜P＜0.05 or P＜0.01). Comprehensive evaluation exhibited that papain hydrolysates could provide an excellent elimination effect on allergens and higher food safety.

South American white shrimp；trypsin; papain；bromelain；hypersensitive test

TS201.6；R151.41

A

1002-6630(2010)17-0263-04

2010-04-01

“十一五”國家科技支撐計劃重大項目(2008BAD94B09)

王麗娟(1961—)，女，教授，碩士，主要從事食品毒理學研究。E-mail：wljuan@tjcu.edu.cn