赭曲霉毒素A模擬表位pⅧ噬菌體表達載體的構建

徐 玲，裘雪梅，劉仁榮*

(江西科技師范學院生命科學學院，江西 南昌 330013)

赭曲霉毒素A模擬表位pⅧ噬菌體表達載體的構建

徐 玲，裘雪梅，劉仁榮*

(江西科技師范學院生命科學學院，江西 南昌 330013)

目的：構建赭曲霉毒素A模擬表位pⅧ噬菌體表達載體。方法：從pⅢ噬菌體隨機肽庫篩選到的多個赭曲霉毒素A模擬表位中取親和力最高的模擬表位，通過化學方法合成兩條包含該模擬表位及核酸內切酶位點的核苷酸序列，退火成雙鏈后與經過相應酶切的pC89S4噬菌體質粒相連，即插入該載體pⅧ前導肽和成熟氨基酸之間，轉化進XL1-Blue感受態細胞中，經XbaⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ三種酶分別酶切初步篩選，測序鑒定。結果：質粒測序與合成的序列一致。結論：即得到高密度赭曲霉毒素A的模擬表位噬菌體展示載體。

赭曲霉毒素A；噬菌體展示； pⅧ；模擬表位

赫曲霉毒A(ochratoxinA，OTA)是自然界中常見的一種毒素[1-2]，對人和動物的腎、肝有強烈的損害性，并具有致癌、致畸和致突變性[3]。利用免疫學方法檢測食品中OTA的存在能有效控制該毒素對人畜健康帶來的危害[4]，但當前免疫學檢測方法需要使用OTA標準品與載體偶聯制備競爭抗原[5]，在對生產和操作人員本身健康造成威脅的同時還存在價格昂貴、進口受限等缺陷[6]。研制OTA競爭抗原的替代品、建立無毒害的免疫學檢測方法具有較大的科學價值和應用前景。近年來新興的噬菌體隨機肽庫展示技術為這一問題的解決提供了新手段[7]。該技術采用大量隨機編碼的多肽序列插入噬菌體展示載體，形成噬菌體展示文庫[8]。以抗OTA

的單抗為配基，可從隨機肽庫中篩選OTA的模擬表位分子，但這種隨機肽庫多肽插入位置在次要衣殼蛋白pⅢ上，表達密度低，不能滿足檢測要求。本實驗在前期成功篩選到赭曲霉毒素A 單克隆抗體及其模擬表位的基礎上[9]，采用分子生物學方法，將赭曲霉毒素A的模擬表位核苷酸序列導入至M13 噬菌體的主要衣殼蛋白pⅧ基因上，構建赭曲霉毒素A抗原表位pⅧ噬菌體表達載體，希望利用pⅧ表達數量多的優勢得到可高效擴增的高密度OTA模擬表位，為制備OTA競爭抗原替代品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌XL1-Blue由本實驗室保存；pC89S4質粒由第三軍醫大學免疫學研究所萬瑛教授惠贈，含有Lac Z啟動子，大腸桿菌Ori，含EcoRⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ等酶切位點，Ampr，M13基因Ⅷ部分序列，3469堿基。

1.1.2 工具酶及試劑

限制性內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ及T4 DNA連接酶 Takara生物公司；質粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒 Fermentas公司；DNA Marker 杭州愛思進生物公司。

寡聚核苷酸單鏈根據前期噬菌體肽庫篩選得到[9]，并設計EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位點接頭，序列為：T1 5＇-AATTCATTCGTCCTATGGTGGATCCG-3＇；T2 5＇-GATCCGGATCCACCATAGGACGAATG -3＇；由上海生工生物工程技術服務有限公司合成及測序。

1.2 方法

1.2.1 OTA模擬表位雙鏈寡聚核苷酸的獲取

將T1和T2加雙蒸水分別配成20pmol/μL的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10μL加于同一0.5mL離心管中，混勻，置于PCR儀，99℃保溫5min，緩慢降溫至室溫，－20℃保存備用。

1.2.2 雙酶切pC89S4噬菌體質粒

取pC89S4質粒16μL，加入2μL的酶切緩沖液K buffer，EcoRⅠ和BamHⅠ各加1μL，混勻，37℃雙酶切2h，按PCR純化試劑盒步驟純化酶切產物。

1.2.3 雙鏈寡聚核苷酸與載體的連接

取10 ×T4 DNA Ligation Buffer 1μL，1.2.1節所得的OTA模擬表位雙鏈寡聚核苷酸4μL，1.2.2節得到的雙酶切產物4μL，T4 DNA連接酶1μL，組成10μL反應體系，于16℃連接過夜，乙醇沉淀法純化。

1.2.4 轉化

連接液全量電轉化入大腸桿菌XL1 - Blue感受態細胞，加入SOC液體培養基，37℃振蕩培養1.5h后涂布含氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養基，37℃過夜。挑單菌落用于擴增細胞，質粒提取試劑盒提取質粒。

1.2.5 陽性菌落的鑒定

先后用XbaⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ對質粒進行酶切，時間為2h，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.6 測序驗證

重組噬菌體采用M13-測序引物證實。

2 結果與分析

pC89S4質粒[10]在EcoRⅠ上游有一個XbaⅠ酶切位點，在EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點之間有另一個XbaⅠ酶切位點，置換掉中間鏈的OTA抗原表位寡核苷酸鏈中沒有該位點(圖1)。利用XbaⅠ酶切可以初步排除pC89S4質粒(圖2a)：在提取的7個轉化子質粒中，4號和7號在200bp左右出現了條帶，其余質粒在3000bp以上僅有單條帶，故4號和7號質粒非陽性克隆。進而用EcoRⅠ酶切剩余的5個質粒，陽性質粒能被EcoRⅠ單酶切(圖2b)，繼而排除不能被該酶酶切的3、5、6號質粒。最后，用BamHⅠ切剩下的1、2號質粒，由于插入序列引入了距原BamHⅠ酶切位點6個堿基的新BamHⅠ酶切位點，陽性質粒應能被該酶切成3448bp的條帶(圖2c)，初步判斷質粒1和2可能含有目的片段。測序驗證質粒1和2中所替換的片段與人工合成片段一致(圖3)。

圖1 pC89-ota表達載體構建示意圖Fig.1 Scheme for construction of vector pC89-ota for expression of OTA mimotope

圖2 酶切鑒定圖Fig.2 Restriction enzyme analysis of the recombinant plasmid

圖3 重組質粒測序波形圖Fig.3 Sequencing results of the recombinant plasmid

3 結 論

噬菌體展示技術[11]是一種基因表達產物和親和選擇相結合的技術，它以改造構建的噬菌體為載體，把能表達免疫原性的目的基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質基因區，使外源多肽或蛋白質表達并展示于噬菌體表面，進而通過親和富集法表達有特異肽或蛋白質的噬菌體[12]。噬菌體結構蛋白pⅢ和pⅧ均可作為載體來展示外源多肽或蛋白質，在基因操作上，它們基本相同[13]。pⅧ是噬菌體的主要衣殼蛋白，噬菌體單鏈DNA 被包裹在大約2700～3000 個pⅧ分子組成的管狀結構中[14]，pⅧ前體由73個氨基酸殘基組成，其中信號肽為23個氨基酸殘基，切除信號肽后的 N 端(1～5 氨基酸殘基區域)為可活動的、外露在噬菌體表面的肽段，是插入外源基因的最佳位置[15]。本實驗成功在噬菌體展示載體pC89S4的pⅧ上插入OTA模擬抗原表位序列，為表達高密度模擬表位，建立OTA競爭酶聯免疫分析方法奠定基礎。

此外，由于OTA抗原模擬表位只有七肽，故構建載體插入的片段僅20余個核苷酸，給陽性克隆的初步篩選帶來麻煩。一般基因工程實驗中常用的陽性克隆的篩選方法為雙酶切和原引物PCR擴增[16]，但這兩種方法均不適合本實驗。本實驗充分利用目的質粒的酶切特性，連續使用3種酶酶切，一步步鎖定目的質粒，具有簡單、快速、高效等優點，可為插入片段過短的質粒篩選陽性克隆提供解決途徑。

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Construction and Identification of a Page pⅧ Vector with the Nucleotide Sequence of Ochratoxin A Mimotope

XU Ling，QIU Xue-mei，LIU Ren-rong*
(College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China)

Objective: To construct a novel vector with the nucleotide sequence of ochratoxin A (OTA) mimotope based on M13 phage with pⅧ gene, which can give a highly efficient amplification of high-density OTA mimotope so as to provide a basis for preparing an alternative to OTA competitive antigen. Methods: The mimotope with the highest affinity was selected out of OTA mimotopes from the random peptide library of phase pⅢ. Two nucleotide sequences containing the nucleotide sequence of this mimotope and endonuclease sites were chemically synthesized, formed into a double-chain sequence by annealing, inserted into the gap between the genes of pⅧ leader peptides and mature amino acids for connection with vector pC89S4 that had been doubly digested with EcoRⅠ and BamHⅠand transformed into XL1-Blue competent cells. The transformed XL1-Blue competent cells were incubated in liquid SOC medium with shaking and then spreaded on solid LB medium in order to provide single colonies for cell amplification before plasmid extraction. The extracted plasmids were separately digested with XbaⅠ, EcoR Ⅰ and BamHⅠ, preliminarily screened and identified by sequencing. Results: The results of plasmid sequencing were in good accordance with the synthetic sequence. Conclusion: A phase display vector that can efficiently amplify high-density OTA mimotope has been successfully constructed.

ochratoxin A；phage display；pⅧ；mimotope

Q812

A

1002-6630(2010)17-0307-03

2010-04-20

國家自然科學基金項目(30860240)；國家“863”計劃項目(2007AA10Z427)

徐玲(1981—)，女，講師，碩士，研究方向為食品安全。E-mail：xuling8739471@163.com

*通信作者：劉仁榮(1969—)，男，教授，博士，研究方向為食品安全。E-mail：lilirenrong@hotmail.com