氣相色譜-質(zhì)譜法測定蜂王漿中的植物甾醇組成

徐 響，孫麗萍,*，董 捷，李天驕，穆雪峰，沈新鋒

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2.國家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心蜂產(chǎn)品分中心，北京 100093)

氣相色譜-質(zhì)譜法測定蜂王漿中的植物甾醇組成

徐 響1,2，孫麗萍1,2,*，董 捷1,2，李天驕1，穆雪峰1，沈新鋒1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2.國家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心蜂產(chǎn)品分中心，北京 100093)

為探明蜂王漿中的植物甾醇組成，蜂王漿樣品經(jīng)凍干、萃取得到王漿脂類物質(zhì)，再經(jīng)過皂化、衍生后使用HP-5MS柱進(jìn)行分離，采用GC-MS對(duì)蜂王漿中甾醇類物質(zhì)進(jìn)行鑒定，并用GC-FID內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明：蜂王漿中除含有少量膽固醇外，還含有25-羥基-24-甲基膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、Δ5-燕麥甾醇、Δ7-燕麥甾醇等植物甾醇；蜂王漿中總甾醇含量在51mg/100g鮮王漿以上。其中，25-羥基-24-甲基膽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和Δ5-燕麥甾醇含量較高，分別占總甾醇含量的36.79%、6.30%、19.75%和27.99%。

蜂王漿；植物甾醇；氣相色譜-質(zhì)譜法

蜂王漿是蜂群中哺育工蜂的舌腺和上腭腺等腺體分泌的一種成分復(fù)雜的乳漿狀物。國內(nèi)外多年科研和醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐證明，蜂王漿對(duì)人類醫(yī)療、保健等具有奇特的功效，除作為上佳的營養(yǎng)食品外，還具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、延緩衰老、抗疲勞、輔助降血糖、降血壓、降血脂等保健功能[1]。

甾醇類化合物廣泛分布于生物界，其基本結(jié)構(gòu)為環(huán)戊烷多氫菲，并含有羥基。植物甾醇能夠防止冠心動(dòng)脈粥樣硬化、抑制人體對(duì)膽固醇的吸收、促進(jìn)膽固醇的降解代謝[2-3]。蜂王漿中的植物甾醇是一類潛在的發(fā)揮保健功能的活性物質(zhì)，因此對(duì)蜂王漿中植物甾醇化合物種類和含量進(jìn)行分析對(duì)揭示蜂王漿的作用具有參考價(jià)值。據(jù)報(bào)道[4-5]，蜂王漿中含有豐富的多肽、蛋白質(zhì)、癸烯酸、維生素、酶類以及其他功能活性物質(zhì)，但是國內(nèi)外對(duì)蜂王漿中植物甾醇的分離和鑒定報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對(duì)蜂王漿中植物甾醇組成進(jìn)行分析，并采用GC-FID對(duì)不同植物甾醇含量進(jìn)行測定，為揭示王漿生理功能作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蜂王漿 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所。

甲醇、乙醇、三氯甲烷、氫氧化鉀、正已烷、吡啶(均為分析純) 北京化工廠；豆甾醇(純度95%)、5α-膽甾烷、雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)-三甲基氯硅烷(TMCS)(體積比99:1) Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890/5975型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；2010型GC-FID氣相色譜儀 日本島津公司；LGJ-18S立式冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 樣品制備

采用文獻(xiàn)[6]的方法提取蜂王漿中的脂類物質(zhì)。取0.500g樣品與10%氫氧化鉀乙醇溶液(m/V)10mL加入到50mL三角瓶中，在80℃水浴中回流加熱30min后，加入40mL飽和NaCl溶液，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，用50mL正己烷在萃取3次，水洗至pH中性后以無水硫酸鈉脫水，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上40℃蒸干。參考文獻(xiàn)[7]的方法硅烷化處理后樣品進(jìn)行色譜分析。

1.4 分析條件

氣相色譜條件：毛細(xì)管柱：HP-5MS柱(30m× 0.25mm，0.32μm)；升溫程序：起始溫度150℃，保持4min，以4℃/min升至240℃，保持2min，然后以12℃/min升至310℃，保持13min。進(jìn)樣口溫度310℃；載氣流速1.0mL/min；分流比20:1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI)；電子能量70eV；離子源溫度230℃；接口溫度300℃；掃描質(zhì)量范圍20～510u。各組分經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照及NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索相匹配，確定其結(jié)構(gòu)。

植物甾醇含量采用GC-FID進(jìn)行測定，色譜FID溫度310℃。以5α-膽甾烷為內(nèi)標(biāo)，豆甾醇為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.9539X+0.0134，X為峰面積與內(nèi)標(biāo)之比，Y為標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物含量之比，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995)，各植物甾醇含量以豆甾醇含量計(jì)。

2 結(jié)果與分析

圖1 蜂王漿中甾醇類化合物GC-MS總離子色譜圖Table 1 GC-MS total ion chromatogram of sterol-TMS ethers in royal jelly

蜂王漿中植物甾醇經(jīng)過衍生化后GC-MS分析檢測，總離子流圖見圖1。各組分經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索及文獻(xiàn)對(duì)照，初步確定出甾醇類化合物組成(表1)。

表1 蜂王漿中甾醇類化合物的組成Table 1 Sterol-TMS ether composition of royal jelly

從表1可看出，蜂王漿中除含有二十八烷、三十烷、二十三烷酸和膽固醇外，還含有6種甾醇類化合物，其結(jié)構(gòu)式見圖2。其中含量較高的為25-羥基-24-甲基膽固醇(6#化合物)、菜油甾醇(7#化合物)、β-谷甾醇(9#化合物)和Δ5-燕麥甾醇(10#化合物)。6#化合物的特征離子為m/z 73、129、296、343、386、470，推測該化合物為25-羥基-24-甲基膽固醇的兩個(gè)三甲基硅醚取代物。7#化合物的離子峰與6#化合物部分重疊，譜庫檢索結(jié)果顯示其為菜油甾醇三甲基硅醚。天然植物甾醇在結(jié)構(gòu)上與膽固醇相似，如豆甾醇(8#化合物)和β-谷甾醇(9#化合物)是常見的植物甾醇，主要存在于植物的根、莖、葉、果實(shí)和種子中，各種植物籽油中含量亦較多[4]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，以上兩種甾醇在蜂王漿中均有檢出，尤其是β-谷甾醇(特征離子m/z 121、129、357、396、486)含量較高[8]。另一種含量較高的植物甾醇是Δ5-燕麥甾醇，其結(jié)構(gòu)式如圖2(F)所示。此外，還有少量的Δ7-燕麥甾醇(11#化合物)，與Δ5-燕麥甾醇相比，它們?cè)诜肿觽?cè)鏈上都有一個(gè)亞乙基，這可能與兩種植物甾醇的抗氧化性有關(guān)[9]。

表2 蜂王漿中各種植物甾醇的含量(±s)Table 2 Identified sterols and their contents in royal jelly±s)

表2 蜂王漿中各種植物甾醇的含量(±s)Table 2 Identified sterols and their contents in royal jelly±s)

植物甾醇名稱含量/(mg/100g鮮王漿)膽固醇2.91±0.23 25-羥基-24-甲基膽固醇19.12±2.34菜油甾醇3.28±0.36豆甾醇1.00±0.16 β-谷甾醇10.27±0.20 Δ5-燕麥甾醇14.55±0.25 Δ7-燕麥甾醇0.86±0.12總含量51.98±2.01

除氣相色譜法外，測定甾醇含量有薄層色譜法、比色法、液相色譜法等[10]，目前對(duì)于各種植物油等樣品中植物甾醇含量的測定多采用氣相色譜-火焰離子化檢測器(GC-FID)進(jìn)行檢測[7,11]。本實(shí)驗(yàn)采用GC-FID內(nèi)標(biāo)法測定蜂王漿中甾醇的含量結(jié)果見表2，結(jié)果表明，蜂王漿中甾醇的總含量高于51mg/100g鮮王漿。膽固醇、25-羥基-24-甲基膽固醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、Δ5-燕麥甾醇、Δ7-燕麥甾醇分別占總甾醇含量的5.60%、36.79%、6.30%、1.91%、19.75%、27.99%和1.66%。Kodai等[12]研究表明，蜂王漿中含有較多種類的甾醇類化合物，這些甾醇類化合物大多含有28或29個(gè)碳原子。蜂王漿中除含有王漿酸、癸二酸、十二碳烯二酸、10-羥基癸酸、以及亞麻酸等脂肪酸外，還含有不同種類的甾醇類化合物。各種脂肪酸、甾醇與多肽、蛋白質(zhì)、維生素、酶類等活性成分相互影響，協(xié)同作用，共同發(fā)揮其重要的營養(yǎng)功能和增強(qiáng)免疫、延緩衰老、抗炎、輔助降血糖、降血壓、降血脂等功效。由此可見，蜂王漿中植物甾醇的分離及分析對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)蜂王漿的保健功能和深入開發(fā)蜂王漿產(chǎn)品具有一定的實(shí)際意義。

3 結(jié) 論

通過GC-MS對(duì)蜂王漿中的甾醇類物質(zhì)進(jìn)行分析，

發(fā)現(xiàn)蜂王漿中除膽固醇外，含有25-羥基-24-甲基膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、Δ5-燕麥甾醇和Δ7-燕麥甾醇等植物甾醇。GC-FID分析表明，蜂王漿中的總甾醇含量高于51mg/100g鮮王漿，主要含有25-羥基-24-甲基膽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和Δ5-燕麥甾醇，分別占總甾醇含量的36.79%、6.30%、19.75%和27.99%。

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Sterol Composition Analysis of Royal Jelly by Gas Chromatography Coupled with Mass Spectrometry

XU Xiang1,2，SUN Li-ping1,2,*，DONG Jie1,2，LI Tian-jiao1，MU Xue-feng1，SHEN Xin-feng1
(1. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. Bee Product Center, National R&D Center for Agro-Food Processing, Beijing 100093, China)

To figure out the sterol composition of royal jelly, royal jelly samples were lyophilized and extracted and the extracted lipid substances were then saponified, derivatized and separated on a HP-5MS column prior to gas chromatography with flame ionization detection (GC-FID ) coupled with mass spectrometric identification of sterols, and quantitative analysis was finally conducted by internal standard method. A small amount of cholesterols was contained in royal jelly, and the main sterols were 25-hydroxy-24-methylcholesterol, campesterol, stigmasterol, β-sitosterol, Δ5-avenasterol and Δ7-avenasterol. The total content of sterols in 100 g of fresh royal jelly was higher than 51 mg. Among these sterols, the most predominant components were 25-hydroxy-24-methylcholesterol, campesterol, β-sitosterol and Δ5-avenasterol, accounting for 36.79%, 6.30%, 19.75% and 27.99%, respectively.

royal jelly；sterol compounds；gas chromatography

TS201.2

A

1002-6630(2010)18-0317-04

2010-06-09

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(nyhyzx07-041)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蜂)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(NYCYTX-43)

徐響(1983—)，男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)榉洚a(chǎn)品化學(xué)。E-mail：caasxx@163.com

*通信作者：孫麗萍(1963—)，女，研究員，碩士，研究方向?yàn)榉洚a(chǎn)品化學(xué)。E-mail：caasun@126.com