長壽老人源雙歧桿菌發(fā)酵雪蓮果飲料的研制

王 洋，劉寧晶，鄭海濤，王 銳，劉麗莎，呂銘洋，李平蘭*

(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室，北京 100083)

長壽老人源雙歧桿菌發(fā)酵雪蓮果飲料的研制

王 洋，劉寧晶，鄭海濤，王 銳，劉麗莎，呂銘洋，李平蘭*

(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室，北京 100083)

以長壽老人源動物雙歧桿菌01(Bifidobacterium animalis 01)發(fā)酵雪蓮果汁，研制一種新型雙歧桿菌活菌飲料。先以活菌數(shù)為響應值進行單因素試驗，篩選出3個具有顯著影響效應的因素——果汁體積分數(shù)、賴氨酸添加量、抗壞血酸(VC)添加量，并確定了各因素最大響應區(qū)間。然后采用響應曲面法旋轉(zhuǎn)中心組合設計(CCD)，Design expert 7.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，建立二次線性回歸方程，得到最佳配方為雪蓮果汁體積分數(shù)50%、賴氨酸添加量0.22%、VC添加量0.21%。終產(chǎn)品感官品質(zhì)良好，活菌數(shù)對數(shù)值高達到(8.23±0.09)lg(CFU/mL)，在4℃條件下貯藏12d活菌數(shù)保持在106CFU/mL以上。

雙歧桿菌；雪蓮果；發(fā)酵飲料；響應曲面法

雙歧桿菌(bifidobacteria)是一類重要的益生菌，在宿主體內(nèi)發(fā)揮著調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制有害菌、營養(yǎng)宿主、增強免疫、抑制腫瘤、延緩衰老等生理功能。雙歧桿菌制品是將雙歧桿菌經(jīng)工業(yè)化擴大培養(yǎng)，再經(jīng)口服回歸宿主原來的生境，發(fā)揮其益生功能的制品。近年來對雙歧桿菌保健制品的研究越來越多。在眾多雙歧桿菌制品中，雙歧桿菌和雙歧因子共同使用的合生元制劑效果最好。

雪蓮果(Smallanthus sonchifolius)根莖含有豐富的果寡糖(約占干物質(zhì)的60%～70%)[1]，大量的水溶性植物纖維以及18種人體必需的氨基酸。有促進腸道雙歧桿菌增殖[2]、改善腸道功能，增強微量元素吸收，調(diào)節(jié)血糖、血脂及抗腫瘤等保健作用。目前雪蓮果多生食，或作烹調(diào)輔料。科研人員正在以雪蓮果為原料，研發(fā)一系列加工產(chǎn)品，如腌制品、風干片、糖果、飲料、乳酸菌發(fā)酵飲料等。 目前還沒有利用雙歧桿菌發(fā)酵雪蓮果汁制備活性飲料的研究報道。

本研究采用的動物雙歧桿菌01(Bifidobacterium animalis 01)菌株來源于廣西巴馬瑤族自治縣長壽老人腸道。前期研究發(fā)現(xiàn)其能耐受消化道逆環(huán)境[3]，且具有抗

氧化，富硒[4]等多種生理活性功能。B. animalis 01發(fā)酵雪蓮果汁活性飲品，兼?zhèn)銪. animalis 01和雪蓮果的保健功效，具有廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮雪蓮果 市售；動物雙歧桿菌01由中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院微生物實驗室提供，中國科學院普通微生物菌種保藏中心專利保藏編號1353。

1.2 培養(yǎng)基和果汁配制

種子培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基[5]；計數(shù)培養(yǎng)基：添加X-gal(60mg/L)的MRS固體培養(yǎng)基。

滅菌的預還原雪蓮果汁制備工藝流程：雪蓮果→清洗→去皮→切分成3cm見方的小塊→預煮8min滅酶→加水打漿→均質(zhì)(調(diào)節(jié)pH7.0)→充氮→滅菌(108℃，20min)。

1.3 種子、發(fā)酵雪蓮果汁制備及活菌計數(shù)

B. animalis 01凍干菌粉于預還原MRS液體培養(yǎng)基中活化3代，恢復活力。接入滅菌的預還原雪蓮果汁中，初始活菌數(shù)對數(shù)值為(5.91±0.07)lg(CFU/mL)，37℃厭氧發(fā)酵30h。活菌計數(shù)采取鑒別性亨蓋特厭氧滾管法[6-7]。

1.4 發(fā)酵果汁質(zhì)量評價

1.4.1 發(fā)酵果汁感官評價

采用模糊數(shù)學七度標度法，由經(jīng)過培訓的10人組成評分小組。評語論域為V=(1，2，3，4，5，6，7)，其中1為最難接受，2為較難接受，3為稍難接受，4為勉強接受，5為較易接受，6為容易接受，7為最易接受。發(fā)酵果汁的評定領域U=(色澤，香氣，酸度，甜度，苦澀味，組織狀態(tài))，其對應的權(quán)重值為X= (0.15，0.20，0.20，0.15，0.20，0.10)[8]。

1.4.2 發(fā)酵果汁理化指標測定

可溶性固形物含量：參照GB 12143.1—88《軟飲料中可溶性固形物的測定方法》；VC含量：2,6-二氯靛藍滴定法[9]；還原糖含量：參照GB/T 5009.7—2003《食品中還原糖的測定》；總糖含量：苯酚硫酸法[10]；總酸含量：參照GB/T 12456—1990《食品中總酸的測定方法》(以乳酸計)。

1.4.3 發(fā)酵果汁4℃厭氧保藏過程雙歧桿菌活菌數(shù)量變化

發(fā)酵果汁于厭氧瓶中4℃保藏，每24h取樣，鑒別性亨蓋特厭氧滾管法計數(shù)雙歧桿菌。

1.5 試驗設計與數(shù)據(jù)處理

1.5.1 單因素試驗

依1.2節(jié)及1.3節(jié)方法制備發(fā)酵果汁，進行活菌計數(shù)。以發(fā)酵終點活菌數(shù)對數(shù)值為響應值，按照雪蓮果汁體積分數(shù)、碳源、氮源、生長因子順序，各因素在前一因素的最佳水平下進行逐級優(yōu)化。在α=0.05的水平下進行單因素方差分析，判斷對發(fā)酵果汁活菌數(shù)的影響有統(tǒng)計學意義的因素及其最大響應水平范圍。

1.5.2 響應曲面法旋轉(zhuǎn)中心組合設計[11](response surface methodology central composite design)與數(shù)據(jù)分析

依據(jù)單因素試驗確定的因素及其水平范圍，以發(fā)酵果汁活菌數(shù)對數(shù)值為響應值，用Design Expert 7.0[12]軟件進行旋轉(zhuǎn)中心組合設計和結(jié)果分析，得到二次線性回歸方程，預測最優(yōu)配方并驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 果汁體積分數(shù)對發(fā)酵果汁活菌數(shù)及感官品質(zhì)的影響

活性發(fā)酵果汁需要具備良好的感官品質(zhì)和較高的活菌數(shù)。在影響發(fā)酵果汁活菌數(shù)的各項單因素中，雪蓮果果汁體積分數(shù)對發(fā)酵終產(chǎn)品感官品質(zhì)有顯著的影響(P＜0.05)，考察雪蓮果汁體積分數(shù)分別為20%、40%、60%、80%、100%時發(fā)酵果汁的感官品質(zhì)。發(fā)現(xiàn)果汁體積分數(shù)為40%、60%、80%的感官得分是可以被大眾接受的(表1)，且果汁體積分數(shù)為60%時終產(chǎn)品感官得分最高；因此選擇40%～80%作為果汁最適濃度范圍，考察各濃度對發(fā)酵終產(chǎn)品活菌數(shù)的影響。圖1顯示，在果汁體積分數(shù)為60%時終產(chǎn)品活菌數(shù)顯著高于其他濃度(P＜0.05)，為(6.82±0.11)lg(CFU/mL)。在60%果汁中添加碳源，發(fā)酵終點活菌數(shù)沒有提高，可能是雪蓮果汁中碳源豐富，能夠滿足雙歧桿菌生長的能量需求，故無需添加碳源。

表1 果汁體積分數(shù)對感官指標的影響Table 1 Effect of volume ratio of yacon juice on the sensory characteristics of the beverage

圖1 果汁體積分數(shù)對發(fā)酵果汁活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of volume ratio of yacon juice on growth of B. animalis 01

2.2 氮源對發(fā)酵果汁活菌數(shù)的影響

在體積分數(shù)為60%的果汁中添加各種氮源(復原乳、豆乳，添加量為1%；半胱氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸，添加量為0.1%)，結(jié)果表明，脫脂復原乳、豆乳、精氨酸、酪氨酸、賴氨酸后對雙歧桿菌生長均有促進作用，其中酪氨酸、精氨酸、賴氨酸效果最為顯著(P＜0.05)。L-賴氨酸是人體必需氨基酸，且為絕大部分中國人的第一限制性氨基酸，故選用賴氨酸作為補充氮源。圖2顯示了賴氨酸的添加量對發(fā)酵飲料活菌數(shù)的影響，賴氨酸添加量分別為0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1.0%。從圖2可知，賴氨酸的添加量對發(fā)酵終點活菌數(shù)的影響顯著(P＜0.05)，且活菌數(shù)隨其添加量的增大呈先增高后降低趨勢，在添加量0.25%時達到最大值(8.01±0.12)lg(CFU/mL)。

圖2 賴氨酸添加量對發(fā)酵果汁活菌數(shù)的影響Fig.2 Effects of lysine level on the growth of B. animalis 01

2.3 生長因子對發(fā)酵果汁活菌數(shù)的影響

圖3 抗壞血酸添加量對發(fā)酵果汁活菌數(shù)的影響Fig.3 Effects of ascorbic acid level on the growth of B.animalis 01

在果汁體積分數(shù)為60%、賴氨酸添加量0.25%的果汁中分別添加各種生長因子(硫酸鋅、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鎂，添加量以金屬離子濃度計為1.5mmol/L；磷酸氫二鉀、氯化鈉、VC、吐溫80，添加量0.1%)。其中，氯化鈉、磷酸氫二鉀、VC對B. animalis 01的增殖有促進作用，且VC對試驗菌株的促生長效果最為顯著(P＜0.05)。進一步考察不同VC添加量(0.05%、 0.1%、0.2%、0.3%)對果汁發(fā)酵過程中雙歧桿菌活菌數(shù)的影響，隨著VC添加量的增大，發(fā)酵終點活細胞數(shù)逐漸增加，在VC添加量為0.20%時達到最高，對數(shù)值為(8.20±0.10)lg(CFU/mL)，添加量再增大，活菌數(shù)沒有顯著提高。

2.4 響應面法優(yōu)化果汁配方

2.4.1 響應面旋轉(zhuǎn)中心組合設計結(jié)果

依據(jù)以上單因素試驗的結(jié)果，選取對發(fā)酵果汁活菌數(shù)影響最為顯著的3個因素——果汁體積分數(shù)、賴氨酸添加量、VC添加量，以發(fā)酵果汁活菌數(shù)對數(shù)值為響應值，進行響應面旋轉(zhuǎn)中心組合設計，各因素水平如表2所示，試驗設計與結(jié)果見表3。利用Design Expert 7.0軟件對表3結(jié)果進行二次多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程：

Y=8.25+0.11A－0.38B+0.0026C－0.0062AB+ 0.00831AC－0.033BC－0.11A2－0.083B2－0.035C2

式中：Y為發(fā)酵果汁活菌數(shù)對數(shù)值；A為果汁體積分數(shù)；B為賴氨酸添加量；C為VC添加量。

方程擬合系數(shù)0.98。對上述回歸方程進行方差分析(表4)表明，模型達到顯著水平，適合對不同配方的發(fā)酵果汁活菌數(shù)進行分析和預測。

表2 響應面旋轉(zhuǎn)中心組合設計因素水平編碼表Table 2 Factors and levels of central composite design

表3 響應面旋轉(zhuǎn)中心組合設計與結(jié)果Table 3 Experimental design and results of central composite design

表4 響應曲面模型及其各項方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

2.4.2 發(fā)酵果汁配方的優(yōu)化

利用Design-Expert 7.0軟件對表3數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，所得二次回歸方程的響應曲面圖和等高線見圖4，可以看出果汁體積分數(shù)和VC添加量，賴氨酸和VC添加量對響應值的交互作用顯著；果汁體積分數(shù)和賴氨酸添加量對交互作用不顯著。根據(jù)二次回歸方程，預測雙歧桿菌發(fā)酵雪蓮果汁的配方為雪蓮果汁體積分數(shù)50%、賴氨酸添加量0.22%、VC添加量0.21%。響應值8.26lg(CFU/mL)。按照此配方進行驗證實驗，活菌數(shù)可達到(8.23±0.09)lg(CFU/mL)，與模型預測值基本吻合，說明該研究所得出的模型是合理的。

圖4 各兩因素交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surfaces and contour plots showing the interactions of volume ratio of yacon juice, level of lysine and ascorbic acid

2.5 B. animalis 01發(fā)酵雪蓮果汁飲料質(zhì)量評價

2.5.1 發(fā)酵飲料感官質(zhì)量評價

以上述優(yōu)化得到的最優(yōu)配方制備發(fā)酵飲料并進行感官評定，結(jié)果見表5。

表5顯示，發(fā)酵后飲料的感官得分5.80，各項指標良好，說明是一種容易被大眾接受的飲料。

2.5.2 發(fā)酵飲料理化指標測定

表5 最優(yōu)配方B. animalis 01雪蓮果發(fā)酵飲料感官評價得分表Table 5 Sensory characteristics of yacon beverage fermented using B. animalis 01

表6 最優(yōu)配方B. animalis 01雪蓮果發(fā)酵飲料各項理化指標Table 6 Physico-chemical properties of yacon beverage fermented using B. animalis 01

表6為最優(yōu)配方發(fā)酵飲料的各項理化指標測定結(jié)果。可以看出，發(fā)酵果汁可溶性固形物含量為(11±1)%、pH4.3、糖酸比為8.8:1。

2.5.3 發(fā)酵果汁貯藏過程雙歧桿菌活菌數(shù)變化情況

圖5 4℃厭氧保藏發(fā)酵果汁中雙歧桿菌活菌數(shù)隨時間的變化Fig.5 Survival of Bifidobacterium animalis 01 in the yacon beverage during storage at 4 ℃

由圖5可以看出，發(fā)酵果汁在貯藏過程中雙歧桿菌活菌數(shù)量緩慢下降，在12d內(nèi)雙歧桿菌活菌數(shù)仍保持在1.0×106CFU/mL(GB 16321—2003《乳酸菌飲料衛(wèi)生標準》對乳酸菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)的最低限量)以上。

3 討 論

雪蓮果富含雙歧因子低聚果糖，B. animalis 01在單純雪蓮果汁中生長活菌數(shù)為(6.82±0.11)lg(CFU/mL)。氮源的添加能夠顯著促進雙歧桿菌的生長，在60%果汁中添加0.1%賴氨酸，發(fā)酵終點活菌數(shù)提高到(8.01±0.08) lg(CFU/mL)。0.20% VC的添加，使活菌數(shù)進一步上升到(8.20±0.10)lg(CFU/mL)。經(jīng)響應面法優(yōu)化得到最優(yōu)配方為雪蓮果汁體積分數(shù)50%、賴氨酸添加量0.22%、VC添加量0.21%。該配方發(fā)酵終點活菌數(shù)達(8.23±0.09) lg(CFU/mL)。

雙歧桿菌對營養(yǎng)要求嚴格，在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長活菌數(shù)在108～109CFU/mL，如嬰兒雙歧桿菌和長雙歧桿菌在補充了碳源的豆?jié){中生長，最高活菌數(shù)分別為8.50CFU/mL和7.93lg(CFU/mL)[13]。動物雙歧桿菌乳亞種Bb-12在MRS中生長最高活菌數(shù)為8.61lg(CFU/mL)[14]。長雙歧桿菌在乳中發(fā)酵24h活菌數(shù)8.79lg(CFU/mL)[15]，陳佩等[16]研制的胡蘿卜紅棗雙歧桿菌發(fā)酵乳飲料的活菌數(shù)高達109CFU/mL。可見，本研究終產(chǎn)品的活菌數(shù)數(shù)量級為108，活菌數(shù)較高，且仍有提高的空間，若在本研究的基礎上，在雪蓮果汁中加入其他果蔬汁成分，有可能得到活菌數(shù)更高且風味優(yōu)良的復合發(fā)酵果汁。不同雙歧桿菌在同一種培養(yǎng)基中生長情況相似，如動物雙歧桿菌乳亞種Bb-12、兩歧雙歧桿菌B7.1、兩歧雙歧桿菌B3.2發(fā)酵胡蘿卜汁，最高活菌數(shù)為8.22～8.96lg(CFU/mL)[17]。本研究所得的配方可能適合多種雙歧桿菌的生長，為開發(fā)一系列雙歧桿菌發(fā)酵雪蓮果汁活性飲品提供參考。

保藏溫度對活菌飲品的貨架期有顯著影響，如嬰兒雙歧桿菌和長雙歧桿菌發(fā)酵豆?jié){在5℃保藏10d，活菌數(shù)分別下降了0.44、3.18lg(CFU/mL)，而在25℃保藏，活菌數(shù)很快降低到106CFU/mL以下[13]。B. animalis 01發(fā)酵雪蓮果汁飲料在4℃厭氧可保存12d，活菌數(shù)保持在106CFU/mL以上。作為一種不經(jīng)過二次殺菌的貨架期較短的活菌飲品，該發(fā)酵飲料適宜采取冷鏈銷售模式。

[1]GRAEFEA S, MERMANNB M, MANRIQUEB I, et al. Effects of postharvest treatments on the carbohydrate composition of yacon roots in the Peruvian Ande[J]. Field Crops Research, 2004, 86: 157-165.

[2]PEDRESCHI R, CAMPOS D, NORATTO G, et al. Andean yacon root (Smallanthus sonchifolius Poepp. Endl) fructooligosaccharides as a potential novel source of prebiotics[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51: 5278-5284.

[3]LIU Ziyu, JIANG Zhijie, ZHOU Kang, et al. Screening of bifidobacteria with acquired tolerance to human gastrointestinal tract[J]. Anaerobe, 2007, 13: 215-219.

[4]ZHANG Bowen, ZHOU Kang, ZHANG Jinlan, et al. Accumulation and species distribution of selenium in Se-enriched bacterial cells of the Bifidobacterium animalis 01[J]. Food Chemistry, 2009, 115: 727-734.

[5]NEVES V A, SILVA M A D. Polyphenol oxidase from yacon roots (Smallanthus sonchifolius)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(24): 2424-2430.

[6]李平蘭, 張篪. 利用亨蓋特厭氧滾管技術檢測雙歧桿菌制品中的活菌數(shù)[J]. 食品科學, 1999, 20(2): 68-69.

[7]CHEVALIER P, ROY D, SAVOIE L. X-a-gal-based medium for simultaneous enumeration of bifidobacteria and lactic acid bacteria in milk[J]. Journal of Microbiological Methods, 1991, 13(1): 75-83.

[8]張麗華, 韓永斌, 劉桂玲, 等. 原汁比例對復合果蔬汁感官品質(zhì)的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報, 2005, 28(4): 122-125.

[9]黃曉鈺, 劉鄰渭. 食品化學綜合實驗[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學出版社, 2007: 171-174.

[10]鐘巖, 潘浦群, 王艷紅, 等. 苯酚-硫酸法測定鮮人參中多糖含量[J].時珍國醫(yī)國藥, 2008, 19(8): 1957-1958.

[11]ROY D, DAOUDI L, AZAOLA A. Optimization of galacto-oligosaccharide production by Bifidobacterium infantis RW-8120 using response surface methodology[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2002, 29: 281-285.

[12]ZHENG Xianzhe, WANG Xin, LAN Yubin, et al. Application of response surface methodology to optimize microwave-assisted extraction of silymarin from milk thistle seeds[J]. Separation and Purification Technology, 2009, 70: 34-40.

[13]CHOU C C, HOU J W. Growth of bifidobacteria in soymilk and their survival in the fermented soymilk drink during storage[J]. International Journal of Food Microbiology, 2000, 56: 113-121.

[14]HEENAN C N, ADAMS M C, HOSKEN R W, et al. Growth medium for culturing probiotic bacteria for applications in vegetarian food products [J]. LWT-Food Science and Technology, 2002, 35: 171-176.

[15]GOMES A M P, MALCATA F X, KLAVER F A M. Growth enhancement of Bifidobacterium lactis Bo and Lactobacillus acidophilus Ki by milk hydrolyzates[J]. Journal of Dairy Science, 1998, 81(28): 17-25.

[16]陳佩, 田呈瑞, 黨輝. 胡蘿卜紅棗雙歧桿菌發(fā)酵乳飲料的研制[J]. 食品科學, 2007, 28(12): 180-182.

[17]SZILARD K, JUDIT M, REZESSY S, et al. Changes of microbial population and some components in carrot juice during fermentation with selected Bifidobacterium strains[J]. Process Biochemistry, 2008, 43: 816-821.

Preparation of Fermented Yacon (Smallanthus sonchifolius) Beverage using Bifidobacterium Strains from Centenarians , Faeces

WANG Yang，LIU Ning-jing，ZHENG Hai-tao，WANG Rui，LIU Li-sha，L. U . Ming-yang，LI Ping-lan*
(Key Laboratory of Function Dairy, Co-constructed by Ministry of Education and Beijing City, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The yacon (Smallanthus sonchifolius) juice was fermented with Bifidobacterium strains derived from centenarians, faeces (Bifidobacterium animalis 01) to prepare a functional beverage. The effects of volume ratio of yacon juice, concentration of lysine and ascorbic acid on the viable bifidobacteria numbers in the fermentation broth were studied by conducting single factor tests. Subsequently, a central composite design involving the above 3 factors at 5 levels was employed and analyzed by response surface method to optimize the fermentation processing. Results showed that the optimum volume ratio of juice was 50%, and optimum concentration of lysine and ascorbic acid was 0.22%, 0.21% respectively. The viable cell numbers of Bifidobacterium animalis 01 at optimal formula could reach up to (8.23±0.03) lg (CFU/mL), and maintained above 106CFU/ mL within 12 days storage at 4 ℃.

Bifidobacterium animal；Smallanthus sonchifolius；fermented beverage；response surface methodology

Q939.99

B

1002-6630(2010)18-0445-05

2010-06-23

國家“863”計劃項目(2008AA10Z324)；北京市自然科學基金項目(5072025)

王洋(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為益生菌與益生元的開發(fā)與利用。E-mail：chaosheng5@163.com

*通信作者：李平蘭(1964—)，女，教授，博士，研究方向為益生菌與益生元的開發(fā)與利用。E-mail：lipinglan420@126.com