鄰二氮菲-Fe2+法測定保健食品的抗氧化能力

劉 薇，王宏君，趙 建，文 悅，文 鏡*

(生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京聯合大學應用文理學院，北京 100191)

鄰二氮菲-Fe2+法測定保健食品的抗氧化能力

劉 薇，王宏君，趙 建，文 悅，文 鏡*

(生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京聯合大學應用文理學院，北京 100191)

目的：用鄰二氮菲-Fe2+法測定保健食品抗氧化能力。方法：以Trolox為標準參照物，通過單因素分析，確定試劑用量及反應時間對線性關系、最低檢測限、平行性精密度、重復性精密度、加標回收率等指標進行測定。結果：Trolox在質量濃度0.01～0.15g/L范圍內線性關系良好；最低檢測下限為0.0050g/L；平行性精密度為(375±12)μmol/g，變異系數3.2%；重復性精密度為(365±16)μmol/g，變異系數4.4%；5次重復加標回收率為(98.0±2.4)%。結論：改良的鄰二氮菲-Fe2+法適用于保健食品抗氧化能力的檢測。

保健食品；抗氧化能力；鄰二氮菲-Fe2+法

多項研究證明衰老以及多種疾病的發生過程都與活性氧有關。因此，與健康關系密切的食品，特別是功能性食品抗氧化能力的測定，以及對生物體內抗氧化水平的分析引起了人們的廣泛關注[1-5]。功能性食品抗氧化能力的體外測定方法相對于體內測定方法簡便、快捷、成本低、人員不需特別訓練，適用于對大批量材料的篩選、抗氧化保健食品市場監督以及在保健食品抗氧化功能評價中作為體內評價結果的旁證[6-7]。體外測定抗氧化物質清除自由基的方法主要包括化學發光法、分光光度法、電子自旋共振法、電化學檢測法、氣相色譜法和熒光法等[8-13]。鄰二氮菲-Fe2+法屬于分光光度法，最初是利用鄰二氮菲可與Fe2+生成橙紅色有色物而用于檢測樣品中Fe2+的方法[14-15]。由于Fenton反應[16]產生的羥自由基能夠氧化反應體系中的Fe2+，由此出現了用于檢測Fenton反應產生羥自由基的鄰二氮菲-Fe2+氧化法，雖然此方法對反應條件的要求較高，影響因素較復雜，但由于所需設備簡單、試劑便宜、操作簡便，此方法還是得到了較為廣泛的應用[17]。但由于原方法是針對Fenton反應產生羥自由基的檢測方法，如果將其應用于對保健食品的檢測就會出現方法線性范圍窄、最低檢測限高、穩定性差、結果表達方式缺乏可比性等不足。目前，對于樣品抗氧化值的表示方法上不同文獻有著各自的表示方法，如：抗氧化劑對羥自由基的清除率表示法[18]、酶活力值表示法[19]，雖然這些也能準確的反應抗氧化劑的能力強弱，但如若不同方法有著各自不同的表示抗氧化強弱的表示，那最終檢測出的數據也就沒有了

可比性。本實驗主要研究鄰二氮菲-Fe2+法的反應條件及反應體系，通過對反應條件及反應體系的改良來彌補原方法的不足，在方法改良過程中將對影響檢測的各種因素進行實驗分析，確定最佳實驗條件，對方法的可行性進行實驗確定。最終達到提高方法穩定性、擴大線性范圍、降低最低檢測限、使測定結果具有可比性、適用于保健食品抗氧化能力體外檢測的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山竹粉、捯捻子素、紅曲粉 義烏章舸生物工程有限公司；葡萄籽膠囊 艾申特生物科技有限公司；保健食品(品名：健康啟程) 北京北衛藥業有限責任公司。

六水合硫酸亞鐵(Ⅱ)銨(硫酸亞鐵銨)、1,10-鄰二氮菲、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、丙酮、環己烷、乙醇、30%雙氧水(均為國產分析純)；抗壞血酸、水溶性VE(Trolox) Sigma公司。

1.2 儀器與設備

HH-4型數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；PP-15專業型pH計、P211D 分析天平 北京賽多利斯有限公司；渦旋混勻器 德國IKA公司；KQ-100B臺式超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；旋轉蒸發裝置(EYELA N-1001旋轉蒸發儀，EYELA SB-2000水浴鍋，SHB-ⅢA型循環水式多用真空泵) 上海愛明儀器有限公司；UV-2450 紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；METTLER AE100電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HS-4IKA WERKE C-MAG加熱磁力攪拌器 廣州儀科實驗室技術有限公司；TDL-5CENTRIFUGE離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 實驗原理

Fe2+與鄰二氮菲能夠生成穩定的橙紅色絡合物在536nm波長有最大吸收峰。反應體系中定量加入的Fe2+和H2O2通過Fenton反應產生羥自由基。自由基和氧化劑將一部分Fe2+氧化為Fe3+，使橙紅色絡合物減少。體系中加入抗氧化劑與體系中自由基和氧化劑反應，使Fe2+的減少受到抑制。用分光光度計測定橙紅色絡合物吸光度的變化即可知道抗氧化劑抗氧化能力的高低。以水溶性VE在反應體系中的抗氧化能力作為標準，以單位質量樣品的抗氧化能力相當于多少水溶性VE來反映被測樣品的抗氧化能力。

1.3.2 試劑配制

按常規方法配制：檸檬酸緩沖液(0.1mol/L、pH4.4)、六水合硫酸亞鐵胺溶液(6mmol/L)、鄰二氮菲溶液(6mmol/L)、雙氧水(0.1%)、Trolox標準儲備液(0.2g/L Trolox)。

1.3.3 樣品的提取

精確稱取樣品(山竹粉0.01g、捯捻子素0.05g、葡萄籽膠囊0.1g、健康啟程0.3g、紅曲粉0.5g等)用30mL去離子水溶解后，超聲提取30min，3000r/min離心10min，將上清液移入100mL容量瓶內，沉淀用50mL去離子水溶解后再提取一次，合并兩次提取液，用去離子水定容至100mL搖勻，即為待測樣品。

1.3.4 測定方法

1.3.4.1 實驗條件的選擇

根據反應機理調整反應體系中主要試劑用量及反應時間，采用單因素分析進行實驗，探索最佳實驗條件。

1.3.4.2 樣品及Trolox的測定方法

按照表1所列順序依次向試管中加入試劑并按表中規定的條件操作。

表1 樣品及Trolox的測定方法Table 1 Reagent composition for antioxidant capacity assessment by phenanthroline- Fe2+method using trolox as the reference substance

每管加入鄰二氮菲后應立即混勻，否則會影響重復性。

1.3.4.3 抗氧化能力值的計算

抗氧化能力值=[(A樣品－A樣品空白－A損傷)/(ATrolox－A損傷)]× [mTrolox/m樣品] (1)

抗氧化能力值以Trolox當量(μmol Trolox當量/g)表示，即1g樣品相當于Trolox的μmol數。式中：A樣品為樣品管吸光度；A樣品空白為樣品空白管吸光度；ATrolox為標準管吸光度；A損傷為損傷管吸光度。mTrolox為標準管所含Trolox的μmol數；m樣品為標準管所含樣品的質量。

1.3.4.4 標準曲線的繪制

將0.2g/L Trolox標準儲備液分別取0.1、0.25、0.5、1.0、1.5mL于試管中，再分別加入1.9、1.75、1.5、1、0.5mL的去離子水，配成質量濃度為0.01、0.025、

0.05、0.1、0.15g/L的Trolox標準品溶液。按表1測定。

1.3.4.5 最低檢測下限

連續測定損傷管吸光度10次，按式(2)計算結果。

式中：D.L為最低檢測限；s為標準偏差；K為斜率。

1.3.4.6 平行性精密度實驗

精確稱取山竹粉0.01g五份，平行操作，用1.3.3節的方法提取后，按表1方法測定。按式(1)計算。

1.3.4.7 重復性精密度實驗

取山竹粉前處理方法同上，每天測定1次，連續測定5d。按式(1)計算。

1.3.4.8 加標回收率實驗

精確稱取0.1000g葡萄籽提取物2份，其中一份定量加入0.0050g標準Trolox，樣品處理及測定方法同上。重復測定5次。按式(1)、(3)計算。

2 結果與分析

2.1 實驗條件的選擇

2.1.1 H2O2用量的選擇

表2 H2O2用量選擇實驗Table 2 Effect of hydrogen peroxide concentration

經過反復實驗發現，H2O2加量為0.05mL時，最低檢測限最小，檢測范圍最寬。H2O2加量過少，自由基產生的不夠，檢測范圍較窄；H2O2加量過多，過量的H2O2與樣品中還原性物質反應，還原性物質對Fe2+保護的靈敏性下降，使得檢測下限偏高。

2.1.2 顯色時間的選擇

表3 顯色時間選擇實驗Table 3 Effect of color development time

經過反復實驗發現，水浴50min為H2O2產生自由基的最佳反應時間。水浴時間不足，自由基產生的不夠，會使得線性范圍較窄；水浴時間過長，會使得更多的Fe2+被H2O2氧化成Fe3+，Fe3+過多會干擾到Fe2+的顏色，因此線性關系不好。改變顯色時間主要是為了擴大線性范圍。如果損傷時間過長，低濃度的抗氧化成分不足以產生作用，造成最低檢測下限有所升高。由此可見反應時間對線性范圍和最低檢測下限都有影響。為了達到擴大線性范圍和降低檢測下限的目的，就要衡量二者，使結果達到最佳。

2.1.3 溶劑的選擇

由于此反應是離子間的氧化還原反應，離子越多實驗的干擾因素也會隨之增多，因此溶劑應選擇去離子水。

2.1.4pH值的選擇

在堿性條件下Fe2+容易和體系中的氫氧根離子形成絮狀沉淀，影響比色，所以選擇了pH4.4的酸性體系，消除了沉淀干擾。

2.1.5 二價鐵試劑的選擇

由于Fe2+不穩定，因此選用和銨根離子結合的硫酸亞鐵銨，穩定性相對有所提高。但使用時最好現用現配。

2.1.6 反應溫度的選擇

為了使反應充分迅速，選用了37℃的水浴條件，但測定時為了減少各管之間存在的反應時間差，各平行管應同時進出水浴鍋，取出時應立即將試管放入冰水浴中，讓37℃反應立刻終止，然后再拿去比色。

2.2Trolox標準曲線的繪制

圖1 Trolox標準曲線Fig.1 Trolox standard curve

應用改良后的方法經過反復實驗發現：Trolox在質量濃度0.01～0.15g/L范圍內有較好的線性關系和較低的檢測下限。

2.3 最低檢測下限實驗

平行測定10次損傷值，結果見表4。

表4 最低檢測下限實驗結果Table 4 Determination of limit of detection

由式(2)計算可得，D.L=3s/K=3×0.006346/3.849= 0.0050g/L。

改良方法測得的結果顯示，最低檢測下限為0.0050g/L。雖然實驗測得的值為0.0050g/L，但在實際樣品測定時，樣品濃度要稍高一些，否則測定結果不明顯。

2.4 平行性精密度實驗

表5 平行性精密度實驗結果Table 5 Relative standard deviation of the method in 5 parallel determinations

用山竹粉進行平行性精密度實驗，其結果為(375± 12)μmol/g，變異系數為3.2%，表明方法的平行性精密度良好。

2.5 重復性精密度實驗

表6 重復性精密度實驗結果Table 6 Relative standard deviation of the method in 5 repeated determinations

用山竹粉進行重復性精密度實驗，結果為(365±16) μmol/g，變異系數為4.4%，表明方法的重復性精密度良好。

2.6 加標回收率實驗

表7 加標回收率實驗結果Table 7 Spike recoveries of the method

用葡萄籽提取物進行加標回收率實驗，5次重復結果為(98.0±2.4)%，表明方法具有較好的準確度。2.75種樣品抗氧化能力的測定

用改良方法順利測定了山竹粉等5種樣品的抗氧化能力，結果見表8。

表8 樣品抗氧化能力測定結果(n=5)Table 8 Antioxidant capacity of some samples using the method

3 討 論

3.1 方法的穩定性

用鄰二氮菲-Fe2+法測定保健食品抗氧化能力，由于自由基是通過Fenton反應產生的，自由基產生量與H2O2有密切關系，反應體系中除了自由基和樣品反應外，氧化劑也會直接參與反應。所以影響體系最終顯色反應的因素較為復雜。只有控制好體系自由基的產生量才能使反應在檢測樣品抗氧化能力過程中穩定、靈敏并且有較寬的檢測范圍。因此需要對影響顯色反應的主要因素進行實驗分析。通過對主要影響因素的選擇實驗，改良后方法的穩定性、靈敏度和檢測范圍都得到了提高。

3.2 掩蔽干擾顯色的離子

反應中Fe2+會被H2O2氧化為Fe3+，當Fe2+和Fe3+共存情況下，Fe3+的干擾是客觀存在且不可忽視的。在酸性條件下Fe3+與H3PO4形成穩定的無色Fe(HPO4)+配離子，從而有效地排除了Fe3+對Fe2+離子測定的干擾。H3PO4不具有氧化性，測定時不參與對Fe2+離子的氧化作用。

3.3 標準樣品的處理

Trolox雖然可以溶于緩沖液中，但溶解困難。因此用磁力攪拌器50℃混勻攪拌溶解不會對Trolox的還原性造成傷害。如果用二甲基亞砜溶解Trolox，雖然溶解效果更好，但二甲基亞砜自身有很強的還原性，對反應體系影響較大，所以選用50℃磁力攪拌溶解的方法。體系中不要加入二甲基亞砜。

3.4 標準物質的選擇

在制作標準曲線時，同時以VC為標準品繪制標準曲線，也同樣做平行性、重復性及穩定性實驗，將其結果與Trolox對比發現VC的穩定性較低。所以選用更穩定的Trolox做標準品，這也相應地提高了標準曲線的線性關系。

3.5 試劑的存放時間

通過實驗發現，試劑放置的時間不同會對實驗結果造成較大的影響。由于反應試劑多是氧化或還原試劑，所以放置時間不宜過長，基本上要現用現配，這樣可以減小誤差。

3.6 檢測樣品的濃度

樣品管的吸光度應在標準曲線的線性范圍之內。若不在此范圍，應采用稀釋或濃縮的方法處理后再測定。但需注意用公式計算結果的時候應將稀釋或濃縮倍數計算進去。

4 結 論

改良后的鄰二氮菲-Fe2+法具有良好的準確度(RSD為3.2%)和精密度(RSD為4.4%)；在0.01～0.15g/L Trolox質量濃度范圍內具有較好的線性關系；以Trolox為標準參照物的結果表達方式使實驗結果更具可比性。改良后的鄰二氮菲-Fe2+法適用于保健食品抗氧化能力的檢測。

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Determination of Antioxidant Capacity of Healthcare Foods by Phenanthroline-Fe2+Method

LIU Wei，WANG Hong-jun，ZHAO Jian，WEN Yue，WEN Jing*
(Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, College of Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Purpose: To develop a phenanthroline-Fe2+method for determining the antioxidant capacity of healthcare foods. Methods: Trolox was used as the

ubstance for antioxidant capacity assessment. Some key determination conditions such as hydrogen peroxide amount, color development time, solvent type, etc were optimized. Method figures of merits including linearity, limit of detection, precision, repeatability and spike recovery were investigated. Results: The developed method presented good linearity when trolox concentration varied from 0.01 to 0.15g/L, with a limit of detection of 0.0050 g/L, a parallel precision (375 ± 12) μmol/g (3.2% variation coefficient), a repeated precision of (365 ± 16) μmol/g (4.4% variation coefficient), and an average spike recovery of (98.0 ± 2.4)% (n = 5). Conclusions: This method is applicable to the determination of antioxidant capacity of healthcare foods.

healthcare foods；antioxidant capacity；phenanthroline- Fe2+method

TS207.3

A

1002-6630(2010)18-0333-05

2010-05-24

北京市教委科技發展計劃項目(KM201011417006)；北京市教委重點實驗室引導基金項目(21202543503)

劉薇(1986—)，女，助理工程師，學士，主要從事保健食品功能評價研究。E-mial：liuwei4465@sina.com

*通信作者：文鏡(1952—)，男，教授，學士，主要從事保健食品功能學評價機理和方法學研究。E-mail：wenjing@ygi.edu.cn