超聲波協同等電點沉淀法提取螺旋藻藻膽蛋白工藝的優化

朱 劼，董文杰，劉 佳

(1.江蘇工業學院化學化工學院，江蘇 常州 213164；2.江蘇工業學院數理學院，江蘇 常州 213164)

超聲波協同等電點沉淀法提取螺旋藻藻膽蛋白工藝的優化

朱 劼1，董文杰1，劉 佳2

(1.江蘇工業學院化學化工學院，江蘇 常州 213164；2.江蘇工業學院數理學院，江蘇 常州 213164)

以螺旋藻粉為原料，通過正交試驗，對超聲波細胞破碎及等電點沉淀提取藻膽蛋白進行研究，并優化其工藝條件。結果表明，在藻液質量分數5%、630W(額定功率為900W)條件下超聲20min，效果最佳；而采用冰醋酸作為等電點沉淀介質，在pH4.0的條件下，從提取液中低溫沉淀藻蛋白，其操作較為簡便。由于冰醋酸溶液易揮發分離，簡化了生產工藝。最后通過冷凍干燥，得到粗蛋白粉末。利用本法優化工藝后，提取液中藻藍蛋白的含量高達4.36%；而經沉淀干燥得到的粗蛋白粉末得率為52.5%，其中藻藍蛋白含量為7.7%、別藻藍蛋白含量為7.9%、藻紅蛋白含量為0.8%。

螺旋藻；藻膽蛋白；超聲波細胞破碎；等電點沉淀

鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)是一種生長在熱帶及亞熱帶堿性湖泊中的微藻類植物，富含各種營養物質及活性成分，如蛋白質、γ-亞麻酸、β-胡蘿卜素、維生素及鈣、鋅、鐵、鉀、鎂、硒等礦物質和微量元素，被聯合國糧食與農業組織稱之為“21世紀人類最理想的天然保健食品”[1-3]。其中，藻膽蛋白的含量高達10%左右，主要有藻藍蛋白(phycocyanin，PC)、藻紅蛋白(p h y c o e r y t h r i n，P E)及別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)等3類。大量實驗表明，螺旋藻膽蛋白具有提高人體免疫力、促進動物血細胞再生、抑制癌細胞生長等作用，同時在抗輻射、抗疲勞、清除自由基等方面也具有一定的生理活性，存在很高的藥

用價值[4-8]。而對于其生物活性蛋白的提取、分離及純化，已成為螺旋藻深加工研究和開發的熱點[9-10]。

超聲波細胞破碎具有高提出率、提取時間短、節約溶劑、低溫提取有效成分等優點[11]；而蛋白質等電點法則利用等電點處蛋白質溶解度最小的原理，在低溫下析出大量蛋白質[12]。本實驗采用超聲波協同等電點沉淀法從螺旋藻粉中提取活性藻膽蛋白，并對其工藝進行優化，為工業化生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

螺旋藻粉 常州溧陽天目湖保健品有限公司；濃硫酸、冰乙酸、NaHPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O等(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FD-1型冷凍干燥機 鞏義市京華儀器有限公司；JYD-900智能型超聲波細胞粉碎機(額定功率900W 上海之信儀器有限公司；TGL-16G型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；FA1104型分析天平 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

藻懸液的配制：稱取一定量的螺旋藻粉，加去離子水混勻，使藻液質量分數分別達到5%、10%、15%，待用；超聲細胞破碎：將配制好的藻懸液在20℃，一定超聲功率下間歇超聲一段時間，按正交表(表1)進行正交試驗；分離上清液：將細胞破碎后的懸濁液在5000 r/min離心20min，收集上清液，并分析其中藻藍蛋白的含量及其純度；等電點沉淀藻膽蛋白：將0.1mol/L的稀硫酸和0.1mol/L的冰醋酸分別加入上清液中，邊滴加邊攪拌混勻，分別調節pH值至3、3.5、4、4.5、5、6，靜置6h后，在4℃以5000r/min離心25min，收集蛋白沉淀；然后采用冷凍干燥的方法得到粗蛋白粉末，計算其得率，并分析其成分。

1.4 正交試驗

表1 超聲波細胞破碎正交試驗設計Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for the optimization of ultrasonic cell disruption

根據預試驗結果[13]，以超聲功率(額定功率900W)、超聲時間及藻懸液質量分數3個因素進行正交試驗，綜合分析提取液中藻藍蛋白含量及其純度，確定最佳超聲細胞破碎工藝條件，方案見表1。

1.5 分析方法

1.5.1 提取液中藻膽蛋白分析方法

螺旋藻中以藻膽蛋白吸收光譜的差異作為其鑒定的標準。藻藍蛋白(PC)最大光吸收在620nm波長處，別藻藍蛋白(APC)在650nm波長處，藻紅蛋白(PE)最大光吸收在490～500nm波長范圍內，藻紅藍蛋白(PEC)在568nm波長處。提取液中藻藍蛋白的純度及各組分質量濃度按如下公式計算[13-15]：

式中：A568、A620、A650分別為蛋白溶液在波長568、620nm和650nm處的吸光度；c為提取液中各蛋白的質量濃度/(mg/mL)，參照公式(2)～(4)計算；V為提取液體積/mL；Y為提取液中各種藻膽蛋白的含量；mSP為藻粉原料的質量/mg。

1.5.2 蛋白沉淀的pH值測定

經等電點沉淀，將離心收集的蛋白沉淀置于通風櫥中敞口干燥，每隔15min，準確稱取0.02g蛋白質沉淀，溶于2.0mL去離子水中，使其質量濃度達到1g/100mL，并測其pH值，用以測試等電點沉淀法中酸性物質稀硫酸及冰醋酸在蛋白沉淀中的殘余情況。

1.5.3 粗蛋白粉末中藻膽蛋白組成及其含量分析方法

冷凍干燥后，準確稱取粗蛋白粉末0.02g，充分溶解于2.0mL磷酸緩沖液(pH7.0)，在4℃、5000r/min離心25min，吸取上清液，在波長568、620、650nm處測吸光度，分別計算粗蛋白粉中藻紅蛋白、藻藍蛋白及別藻藍蛋白的含量。計算公式如下[9]：

式中：m＇SP為經冷凍干燥后，得到的粗蛋白粉末質量/mg；C＇為粗蛋白粉末溶解于磷酸緩沖液后各蛋白的質量濃度/(mg/mL)，參照公式(2)～(4)計算；V＇為蛋白溶液體積/mL；Y＇PC為粗蛋白中藻藍蛋白的含量1/%，參照公式(7)計算；YPC為最初提取液中藻藍蛋白的含量1/%，參照公式(5)計算。

2 結果與分析

2.1 螺旋藻細胞超聲破碎工藝條件的確定

根據表1中三因素三水平的條件，設計L9(34)正交試驗表，采用極差分析，以確定超聲破碎細胞的最佳工藝條件，試驗結果見表2。

表2 超聲細胞破碎工藝正交試驗結果Table 2 Arrangement and experimental results of orthogonal array design for the optimization of ultrasonic cell disruption

從表2中藻藍蛋白含量的極差分析(R)可以看出，對于提取液中的藻藍蛋白含量而言，3個影響因素中，藻液質量分數對其影響最大，超聲功率次之，而超聲時間的影響最小。結果表明，藻液的配比濃度對超聲波細胞破碎影響最大，其主要原因有兩點：首先，藻粉在懸濁于水的過程中本身需要吸收一定的水量，故作為超聲波介質的水溶劑量相對減少。由于超聲波具有在液相中吸收大于在固相中吸收的特性，因此，隨著藻懸液濃度的減少，水溶劑量增大，細胞受超聲的刺激也增大，破壁率也隨之提高，致使大量胞內蛋白溶出；其次，由于藻膽蛋白在超過30℃就開始變性[13]，故提取藻膽蛋白應盡可能在低溫下進行。超聲波會產生很強的熱效應，若藻液濃度較高，超聲所產生的熱量在局部不易擴散，部分蛋白可能會受熱變性，導致所測蛋白含量下降。從結果還可以看出，隨著藻液質量分數的降低，經超聲后，提取液中藻藍蛋白的含量也不斷增加。因此，選擇藻液質量分數為5%。

對于超聲功率而言，對細胞破碎具有一定的影響。超聲功率越大，它所產生的超聲波越強，對細胞的破壞性也越大。從結果看，也符合這一規律。隨著超聲功率的加強，提取液中藻藍蛋白的含量也有增加的趨勢；但超聲波的熱效應亦在不斷增強，可能會造成局部蛋白的變性。從這個角度考慮，超聲功率應盡可能小一些。從表2可以看出，超聲功率的第二、三水平，即630W及720W的結果較為接近，因此，綜合藻藍蛋白含量及成本考慮，選擇630W超聲功率比較合適。

本實驗所選擇的超聲時間對于細胞破碎的影響最小。這一因素的3個水平，實驗結果較為接近。說明超聲時間超過15min，細胞的破壁率已經基本穩定，增加量較少；隨著時間的延長，超聲波的熱效應也會逐漸增加，因此，從成本角度考慮，可選擇第一個水平15min。

綜上分析，對于提取液中藻藍蛋白的含量，從工業化角度考慮，最優組合為A2B1C3。

從表2中藻藍蛋白純度的極差分析(R＇)可以看出，超聲功率對藻藍蛋白純度的影響最大，藻液質量分數次之，而超聲時間影響最小。

超聲功率對于藻藍蛋白純度的影響較為明顯。從實驗結果看，630W超聲時，藻藍蛋白的純度最大；而低于或高于630W時，純度均出現下降趨勢。原因可能為，細胞破碎過程中，藻紅蛋白首先被釋放到溶液中，然后再為藻藍蛋白和別藻藍蛋白。因此，當超聲功率較小時，細胞破碎較慢，釋放到溶液中的藻藍蛋白較少；隨著功率逐漸增加，細胞破碎加快，破碎程度也加大，使得藻藍蛋白的釋放量增加，純度提高；但功率繼續加強，導致熱效應增加，而藻藍蛋白易發生變性，純度再次降低，故超聲功率選用630W。

對藻液質量分數而言，隨著質量分數的降低，純度不斷上升，可能是由于破壁率提高和熱效應減少共同影響的結果。因此，藻液質量分數可選擇5%；對于超聲時間，正如上一節的推測，隨著時間的延長，大

量的藻藍蛋白被釋放到溶液中，純度提高，而第二、三水平，即超聲20min及30min的結果幾乎沒有差別，可認為超聲20min后，藻藍蛋白的釋放已相對穩定，故可選擇第二個水平20min。因此，對于提取液中藻藍蛋白的純度，最優組合為A2B2C3。

通過以上分析，藻藍蛋白含量及純度的最優組合出現差異，主要在超聲時間上。由于超聲15min和20min，對于藻藍蛋白的含量幾乎沒有太大區別，而對于其純度存在一定的影響，故綜合含量及純度，最優條件組合為A2B2C3，即藻液質量分數5%、超聲功率630W、超聲時間20min。

2.2 等電點沉淀工藝的確定

2.2.1 pH值對提取藻藍蛋白的影響

分別以稀硫酸及冰醋酸溶液為等電點介質進行蛋白沉淀實驗，其結果見表3、4。

表3 不同pH值的稀硫酸溶液對提取藻藍蛋白的影響Table 3 Effect of pH on phycocyanin precipitation by the addition of dilute sulfuric acid

表4 不同pH值的冰醋酸溶液對提取藻藍蛋白的影響Table 4 Effect of pH on phycocyanin precipitation by the addition of glacial acetic acid

由表3、4可知，采用稀硫酸和冰醋酸作為等電點沉淀的介質，在蛋白沉淀效果方面基本相似。當pH值為4.0時，粗蛋白得率最大達到52.5%。其中藻藍蛋白的含量為7.7%，提取率為92.7%。但在藻藍蛋白的含量方面，pH4.5時最高，占粗蛋白總量的8.3%左右。由此推測，藻藍蛋白的等電點可能位于4.0～4.5之間，當pH值從4.0升至4.5時，藻藍蛋白的沉淀量下降較為緩慢，而其他藻蛋白的等電點偏離4.5相對較遠，沉淀量下降較快，使得藻藍蛋白在粗蛋白中的比重有所上升。當pH值降至3.0時，發現蛋白開始變性，部分蛋白沉淀不能溶于磷酸緩沖液，故藻藍蛋白含量及提取率迅速下降。因此，從生產角度考慮，選擇pH值為4.0時進行操作較為合適。

2.2.2 等電點介質對提取藻藍蛋白的影響

由于采用等電點沉淀需要引入額外的化學試劑硫酸及冰醋酸，故在提取蛋白過程中必須考慮其在蛋白中的殘留情況。本實驗以蛋白沉淀pH值的變化為依據，來說明介質在沉淀中的殘留情況。

圖1 放置時間對不同等電點介質提取蛋白質pH值的影響Fig.1 pH change during standing for phycocyanin precipitation by the addition of dilute sulfuric acid or glacial acetic acid

從圖1可以看出，離心后的蛋白沉淀置于通風櫥中，隨著放置時間的延長，使用冰醋酸作為沉淀介質的樣品中，pH值不斷上升，45min后，即由酸性轉為中性；而相同時間內，使用稀硫酸作為沉淀介質的樣品，其pH值變化不明顯。由此可以推斷，由于冰醋酸易揮發的特點，殘留于沉淀中的少量冰醋酸溶液，隨著時間延長不斷揮發，且溶質冰醋酸的揮發速度高于溶劑水的速度，使得在較短時間內，便可除去絕大部分冰醋酸；而硫酸不易揮發的特點，使得其在蛋白沉淀中不易除去。因此，從操作性及成本考慮，可采用易揮發的冰醋酸替代硫酸作為等電點沉淀的介質。

綜合等電點介質及pH值對藻藍蛋白提取的影響，采用冰醋酸介質，在pH值為4.0的條件下進行藻蛋白提取，可達到較好的效果。

2.3 粗蛋白中藻膽蛋白成分分析

根據公式(2)～(4)及(7)進行計算，在所提取的粗蛋白中，藻藍蛋白含量Y＇PC為7.7%；別藻藍蛋白含量Y＇APC為7.9%；藻紅蛋白含量Y＇PE為0.8%。

3 結 論

通過正交試驗，優化了超聲波細胞破碎及等電點沉淀的工藝條件，實現了在低溫下，較為便捷的從螺旋藻粉中提取活性藻膽蛋白操作。結果表明，超聲波細胞破碎的最優條件為：藻液質量分數5%、超聲功率630W、超聲時間20min；而等電點沉淀則采用冰醋酸為介質，在pH值為4.0的條件下提取蛋白。經分析，

粗蛋白得率為52.5%；在粗蛋白中，藻藍蛋白占7.7%、別藻藍蛋白占7.9%、藻紅蛋白占0.8%。

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Ultrasonic Cell Disruption Followed by Isoelectric Point Precipitation for Extraction of Phycobiliprotein from Spirulina platensis

ZHU Jie1，DONG Wen-jie1，LIU Jia2
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Jiangsu Polytechnic University, Changzhou 213164, China；2. School of Mathematics and Physics, Jiangsu Polytechnic University, Changzhou 213164, China)

A procedure based on ultrasonic cell disruption followed by isoelectric point precipitation was considered for the extraction of phycobiliprotein from Spirulina platensis powder. The respective optimal conditions for ultrasonic cell disruption and isoelectric point precipitation were determined. Results showed that an optimal ultrasonic cell disruption was obtained through 630 W ultrasonic treatment for 20 min of 5% aqueous suspension of Spirulina platensis powder. The optimal medium was glacial acetic acid for the isoelectric point precipitation of phycobiliprotein, which was a simple and convenient operation to obtain phycobiliprotein at pH 4.0 and 4 ℃. Glacial acetic acid is easy to volatilize so that the extraction procedure is simplified. Finally, lyophilization was performed to obtain a crude protein powder. The content of phycocyanin was as high as 4.36% in the supernatant separated from ultrasonic treated 5% aqueous suspension of Spirulina platensis powder under optimized conditions, and the yield of crude protein powder from Spirulina platensis powder was 52.5%, in which, the contents of phycocyanin, allophycocyanin and phycoerythrin were 7.7%, 7.9% and 0.8%, respectively.

Spirulina platensis；phycobiliprotein；ultrasonic cell disruption；isoelectric point precipitation

TS201.1

A

1002-6630(2010)10-0146-05

2009-08-16

溧陽市天目湖保健品有限公司合作項目

朱劼(1977—)，男，講師，博士，主要從事生物醫藥開發及生物活性成分的提取研究。E-mail：zhujie_bit@yahoo.com.cn