酶膜生物反應器制備抗凝血酶蛋清水解物的研究

楊萬根，程云輝，王 璋

(1.徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221008；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；3.長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114)

酶膜生物反應器制備抗凝血酶蛋清水解物的研究

楊萬根1,2，程云輝3，王 璋2

(1.徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221008；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；3.長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114)

采用酶膜生物反應器(EMBR)制備抗凝血酶蛋清水解物，并用人工神經網絡方法優化工藝。在0.13～0.15MPa條件下，采用L18(37×21)混合水平正交試驗考察底物質量分數、酶質量分數、pH值、溫度、濾過液流速和水解時間對蛋清水解物的抗凝血酶生物活性的影響，并用多層前饋網絡(BP神經網絡)對EMBR酶解的過程進行模擬和預測，獲得抗凝血酶水解產物的最優制備工藝條件。結果表明，在底物質量分數1%、酶質量分數1%、pH8.0、溫度55℃、濾過液流速10mL/min、水解時間4h時，產物的最低抗凝血酶IC50預測值為10.43mg/mL，與實測值僅相差4.03%，說明采用EMBR制備蛋清酶解物的方法可行，并經人工神經網絡方法優化得到了抗凝血酶蛋清水解物的最優制備條件。

酶膜生物反應器；蛋清；多層前饋網絡(BP神經網絡)；抗凝血酶活性；優化

自1985年以來，我國雞蛋產量就一直位居世界首位，在2005年雞蛋產量已占世界產量的40%以上[1]。在一些食品行業中，蛋黃被用做糕點、月餅的原料，而蛋清常常作為廢棄物被拋棄，既污染了環境，又浪費了寶貴的蛋白質資源。因此，開發和利用豐富的蛋清資源具有重要意義。蛋清是含有10.6%蛋白質的水溶液，當前開發蛋清的一種新途徑是以蛋清蛋白質為原料，以生物酶解的方法制備具有一定生物活性的水解物用于各種運動營養品和保健食品中[2-3]。酶膜生物反應器(enzymatic membrane bioreactor，EMBR)是將膜過濾和酶催化反應結合在一起的系統，可以用于連續制備小分子蛋白質水解物，比目前常用的批次酶解法具有節省酶成本、底物轉化率高及產物品質均一等優點[4-5]，是一種比較先進的方法，已被應用于制備各種

蛋白質來源的水解物[6-7]。

EMBR制備水解物的過程受到較多因素的影響，一般的優化方法例如響應面分析法，因實驗工作量太大而不適合對E M B R酶解工藝進行優化。M a t l a b是Mathworks公司研制的一套高性能的數值計算和可視化軟件，其中的人工神經網絡工具箱是用Matlab語言開發出來的諸多工具箱之一，網絡的設計者可以根據自己的需要去調用工具箱中有關人工神經網絡的設計與訓練函數，從而提高效率和解題質量。人工神經網絡技術在多因素工藝優化方面具有降低工作量的優勢[8]，如趙武奇等[9]用人工神經網絡優化出最佳的蘋果籽油乳化工藝參數；李興江等[10]用神經網絡分析秸稈水解液經發酵產琥珀酸的工藝，具有抗凝血酶活性的蛋白水解物可以用于防治心血管疾病病人發生血栓病，在醫藥和保健食品行業有著廣闊的應用前景[11]。因此，本實驗采用EMBR制備抗凝血酶蛋清水解物，并設計3層前饋網絡(BP神經網絡)，對制備過程進行模擬和預測，最終獲得EMBR制備抗凝血蛋清水解物的最優生產工藝，為產業化EMBR酶法制備蛋清水解物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋清粉 自制；Protease N“Amano” Amano酶制劑公司；凝血酶(牛血清)、纖維蛋白原(牛血清) Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

超濾系統：配有BiomaxTM10聚醚砜超濾膜膜包(截留面積0.1m2，截留相對分子質量104)、PelliconTM-2 Mini膜夾具、Millipore蠕動泵 美國Millipore公司；Plus384酶標儀 美國Molecular Devices公司；夾套玻璃反應器無錫湖景玻璃儀器商店。

1.3 方法

1.3.1 酶解工藝

酶解工藝如圖1所示。配好2L一定濃度的蛋清溶液，調節pH10，迅速升溫至85℃并恒溫30min；反應器夾套中的水溫預先升至水解溫度，將熱處理好的1L蛋清溶液轉入2L容積的反應器中，用強力攪拌機在500r/min速度條件下攪拌，使蛋清溶液冷卻到水解溫度并恒定。其余蛋清溶液作補液，在60℃恒溫水浴中保溫。調節反應器中的蛋清溶液達到預定的水解pH值，加入Protease N蛋白酶開始水解。在水解初始0.5h內，關閉超濾裝置，使反應在反應器中進行，之后開啟超濾裝置。為了避免泵入水解液溫度超過50℃而對膜包造成損害，超濾裝置前加有冷凝裝置；進樣壓力設定在0.13～0.15MPa；水解過程中添加蛋清補液使反應液體積不變，并滴加1mol/L的NaOH溶液使反應液pH值恒定；到達預定水解時間后，終止反應。

圖1 蛋清酶解工藝示意圖Fig.1 Sketch map showing the egg white protein hydrolysis in an enzymatic membrane reactor

1.3.2 正交試驗設計

在前期研究基礎上[12]，采用L18(37×21)混合水平正交試驗考察底物質量分數(A)、酶質量分數(B)、pH值(C)、水解時間(D)、濾過液流速(E)、溫度(F)對水解物抗凝血酶活性的影響，因素水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the L18(37×21) mixed-level orthogonal array design

1.3.3 BP神經網絡的設計及訓練

選用表1所得的正交試驗結果中18組試驗數據作為學習樣本，6個酶解工藝參數作為輸入，抗凝血酶活性指標為輸出。以Matlab語言中的人工神經網絡工具箱為工具進行編程，選用6個輸入神經元(X1～X6)，18個隱含層神經元(P1～P18)和1個輸出神經元(y)的BP神經網絡(圖2)。為方便計算，首先將參數進行歸一化處理，分別用1～3代表試驗中各因素的3個水平(表1)。隱含層采用對數S型傳遞函數(logsig)，輸出層采用純線性函數(p u r e l i n)，學習函數為帶動向量的B P學習函數(l e a r n g d m)，訓練函數為成比例的共軛梯度算法(trainscg)，設定指標的訓練均方差為10-2，完成訓練擬合步數小于10000步，組成訓練集對網絡進行訓練。

圖2 BP結構網絡Fig.2 Architecture for BP neural networks

1.3.4 BP神經網絡對酶解過程的模擬和優化

利用訓練好的BP神經網絡考察試驗中重要因素對抗凝血酶活性的影響，并經過Matlab數值仿真得到最大輸出條件，然后進行實驗驗證。

1.3.5 蛋白質含量測定

采用Lowry法[13]測定。

1.3.6 抗凝血酶活性測定

采用酶標儀法[14]測定。水解物的抗凝血酶活性用IC50值來表示，其定義為抑制50%的凝血酶活力所需的蛋清水解物濃度。

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果

表2 L18(37×21)混合水平正交試驗結果Table 2 Arrangement of the L18(37×21) mixed-level orthogonal array design and experimental results of the antithrombin activity of EWH

蛋清中含有多種對蛋白酶有抑制作用的物質，如卵類黏蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制物、卵抑制物和卵固蛋白等[15]。由于這些抑制物的存在，導致水解蛋清所需的酶質量分數增大或者水解度不理想，因此必須在EMBR酶解蛋清前對蛋清進行熱處理，以使其中的蛋白酶抑制物發生變性或部分變性而失去抑制能力，提高酶解效果。對蛋清熱處理的另一個優點是可以通過調節pH值，在熱處理中形成低黏性的溶液，使蛋清呈現出原先沒有的良好流體性質，以有利于蛋清物料在管路中的傳送、超濾和水解。已有研究表明，調節蛋清pH10進行30min的熱處理能達到以上目的，因此試驗中采用該條件進行水解前的熱處理[16-17]。

熱處理后的蛋清進行酶解的正交試驗結果見表2，極差分析結果見表3。對表2中各因素的R值大小排序可知因素的重要性次序，但是，各因素的效應是否真正對試驗有影響，還需將其R值與空列的R值比較，當因素的R值大于空列R值時才能說明該因素的效應存在。由表3顯示，水解時間和底物質量分數的R值小于空列的R值，故它們的影響效應不明顯，由此因素的重要性排序為濾過液流速＞酶質量分數＞pH值＞溫度。由Ki值可知，對抗凝血酶活性而言，EMBR制備蛋清水解物的最佳工藝條件為底物質量分數1%、酶質量分數1%、pH8.0、水解時間4h、濾過液流速10mL/min、溫度55℃。

表3 正交試驗結果極差分析Table 3 Range analysis for the antithrombin activity of EWH with various hydrolysis conditions

2.2 BP神經網絡的訓練

圖3 BP神經網絡訓練Fig.3 Training of BP artificial neural networks

利用Matlab的神經工具箱對圖2的BP神經網絡進

行訓練，結果顯示在迭代步數為2974時，均方差為0.00855164，達到了預定的均方差小于10-2(圖3)，因此所建的BP神經網絡能夠在規定的跌代步數內達到預期的訓練目標。

2.3 BP神經網絡對酶解過程的優化

由極差分析結果可知，濾過液流速、酶質量分數和pH值對水解物的抗凝血酶活性有重要影響，但考慮到實際工作中濾過液流速和pH值的影響更為重要，因此使用BP神經網絡考察濾過液流速與底物質量分數、pH值與底物質量分數對抗凝血酶活性的影響，進而確定濾過液流速、p H值和底物質量分數的最佳工藝參數，它們對抗凝血酶活性的影響見圖4、5。

圖4 BP神經網絡考察pH值與底物質量分數對抗凝血酶活性的影響Fig.4 Effects of pH and substrate concentration on the antithrombin activity of EWH investigated using BP artificial neural networks

圖5 BP人工網絡考察濾過液流速與底物質量分數對抗凝血酶活性的影響Fig.5 Effects of filtration flow rate and substrate concentration on the antithrombin activity of EWH investigated using BP artificial neural networks

由圖4可知，pH值和底物質量分數對抗凝血酶活性存在影響，在pH8.0、底物質量分數1%時有抗凝血酶活性的最低IC50值。由圖5可知，底物質量分數和濾過液流速同樣對抗凝血酶活性存在影響，在底物質量分數1%、濾過液流速10mL/min時有最低IC50值。經Matlab數值仿真，當pH8.0、底物質量分數1%、酶質量分數1%、濾過液流速10mL/min、溫度55℃、水解時間4h時，得到BP神經網絡預測的最低抗凝血酶活性IC50值為10.43mg/mL。經相同條件實驗驗證，產物的IC50值為10.85mg/mL，與預測值相差4.03%。從預測值和實測值的誤差可以看出，訓練得到的BP神經網絡具有較好的預測性，可作為此水解過程的模擬和預測工具。

3 結 論

本研究發現EMBR制備蛋清蛋白水解物的各參數中，濾過液流速、p H值、酶質量分數和溫度對抗凝血酶活性存在影響效應，并且利用人工神經網絡對EMBR水解過程進行了控制和仿真，實現了EMBR制備蛋清水解物的模擬和預測，為今后EMBR制備蛋清水解物的中試實驗提供參考。

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Use of Artificial Neural Networks for the Optimization of Preparation of Egg-white Hydrolysate with Antithrombin Activity in an Enzymatic Membrane Bioreactor

YANG Wan-gen1,2，CHENG Yun-hui3，WANG Zhang2
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；3. School of Chemical and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

An enzymatic membrane reactor designed based on the combination of membrane filtration and Protease N Amanocatalyzed hydrolysis was used to prepare egg-white hydrolysate (EWH) with antithrombin activity. A L18(37×21) mixed-level orthogonal array design was used to investigate the effects of substrate concentration, enzyme dosage, pH, temperature, filtration flow rate and length of hydrolysis on the antithrombin activity of EWH. This was followed by the stimulation and predication of EW hydrolysis using back propagation (BP) neural networks to obtain the optimal values of the above parameters. The results showed that the predicted value of IC50of EWH obtained under the following optimized conditions: substrate concentration 1%, enzyme dosage 1%, filtration flow rate 10 mL/min, and length of hydrolysis 4 h was 10.43 mg/mL, 4.03% lower then the actual value. This demonstrates good reliability of BP neural networks in optimizing egg white protein hydrolysis.

enzymatic membrane bioreactor；egg white；back propagation (BP) neural network；antithrombin activity；optimization

TS253.9

A

1002-6630(2010)10-0159-04

2009-08-07

楊萬根(1974—)，男，講師，博士，研究方向為生物技術在食品中的應用。E-mail：yangwangen08@163.com