水產(chǎn)品金黃色葡萄球菌檢驗結(jié)果不確定度的評定

王李寶，凌 云，劉綠葉，沈 輝，萬夕和

(江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007)

水產(chǎn)品金黃色葡萄球菌檢驗結(jié)果不確定度的評定

王李寶，凌 云，劉綠葉，沈 輝，萬夕和

(江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007)

目的：評定水產(chǎn)品金黃色葡萄球菌檢驗結(jié)果的不確定度。方法：采用統(tǒng)計學(xué)方法對日常檢驗數(shù)據(jù)進行不確定度評定。結(jié)果：擴展不確定度為0.1，適合于每一個水產(chǎn)品樣本的檢測結(jié)果。結(jié)論：利用日常檢驗數(shù)據(jù)評定金黃色葡萄球菌檢驗結(jié)果的不確定度是可行的。

水產(chǎn)品；金黃色葡萄球菌；不確定度評定

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種引起人類和動物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一[1-2]。為了確保金黃色葡萄球菌檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，嘗試將其檢驗結(jié)果不確定度的評定引入到日常的檢驗工作中。而測量不確定度是衡量測試結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的重要參數(shù)。測量結(jié)果不確定度評定是實驗室質(zhì)量體系的重要組成部分，是測量實驗室質(zhì)量管理的重要內(nèi)容，也是ISO/IEC17025的要求。尤其當(dāng)不確定度影響到與規(guī)范限度的符合性時，測量不確定度的信息顯得特別重要[3-4]。檢驗結(jié)果的可用性很大程度上取決于測量結(jié)果不確定度的大小。所以，檢驗結(jié)果不確定度的評定對實驗方法的可靠性有科學(xué)的指導(dǎo)意義[5-6]。

本研究采用GB/T 4789.37—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗：金黃色葡萄球菌計數(shù)》中的第一法[7]對本實驗室抽檢的南通地區(qū)2007～2009年的水產(chǎn)品(干紫菜)金黃色葡萄球菌進行檢驗，找出影響輸入量的各種因素，計算各種不確定度分量，計算合成不確定度和擴展不確定度，從而對檢驗結(jié)果的質(zhì)量給出定量的說明，以確定檢驗結(jié)果的可信程度，進而掌握類似檢驗方法的測量不確定度的評定程序。

1 評定方法的選擇

假設(shè)檢驗樣品是均勻的，在實驗室內(nèi)由相同人員在同一檢驗環(huán)境按同一檢驗標(biāo)準(zhǔn)進行檢驗。鑒于檢驗過程對樣品進行10倍稀釋，因此對檢出金黃色葡萄球菌的檢驗結(jié)果取對數(shù)，再用統(tǒng)計學(xué)方法(A類)評定此類樣品的金黃色葡萄球菌計數(shù)檢驗結(jié)果的不確定度。

2 檢驗方法和檢驗流程

2.1 試劑與儀器

本研究中所采用的培養(yǎng)基均采購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，所用主要儀器有恒溫培養(yǎng)箱和電子天平等，均符合GB/T 4789.37—2008計數(shù)中試劑和儀器的要求。

2.2 樣品中金黃色葡萄球菌的計數(shù)

根據(jù)GB/T4789.37—2008計數(shù)中第一法進行檢驗。

2.3 結(jié)果計算

根據(jù)GB/T 4789.37—2008中第一法的計算方法。

3 不確定度分量的主要來源及分析

檢驗結(jié)果的不確定度來源如圖1所示。

圖1 檢驗結(jié)果的不確定度來源Fig.1 Analysis of source of measurement uncertainty in the enumeration of Staphylococcus aureus in aquatic products

4 不確定度的評定

4.1 樣品稱量過程產(chǎn)生的不確定度

本實驗室嚴格依照GB/T 4789.1—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗：總則》[8]規(guī)定，在無菌條件下將樣品充分混勻后隨機取樣，均質(zhì)袋拍擊速度和拍擊時間嚴格按照GB/T 4789.37—2008中規(guī)定執(zhí)行。

GB/T 4789.37—2008要求準(zhǔn)確稱量25g被測樣品，本實驗室采用精度為0.01g的電子天平，根據(jù)JJG1036—2008《中華人民共和國計量檢定規(guī)程：電子天平》規(guī)定[9]，該準(zhǔn)確級(Ⅱ)的天平在0～500g稱量范圍的MPE為±0.5g，天平線性MPE為矩形分布，天平稱量引入的不確定度為：

4.2 樣品稀釋過程中儀器所產(chǎn)生的不確定度

樣品稀釋采用1mL移液器和10mL移液管進行梯度稀釋。JJG646—2006《中華人民共和國計量檢定規(guī)程移液器檢定規(guī)程》[10]規(guī)定：1000μL可調(diào)移液器吸取1mL時容量允差為±1.0%，取矩形分布；JJG196—2006《中華人民共和國計量檢定規(guī)程常用玻璃量器》[11]規(guī)定：20℃時10mL移液管(A級)的容量允差為±0.05mL，取矩形分布。因此，由可調(diào)移液器及吸管導(dǎo)致的不確定度分別為：

因此，樣品稀釋過程中所產(chǎn)生的不確定度為：

本實驗是在20℃的條件下進行的，因此，容量瓶和溶液溫度與校準(zhǔn)時溫度不同引起的不確定度為零。當(dāng)溫度不為20℃時，必須考慮溫度對體積的影響。

4.3 樣品重復(fù)性檢驗的不確定度

在相同條件下，對同一份金黃色葡萄球菌污染的樣品進行了10次獨立檢驗，檢驗結(jié)果為1.25×102、1.3 ×102、1.25×102、1.3×102、1.4×102、1.25×102、1.25×102、1.25×102、1.25×102、1.25×102CFU/g。為了計算不確定度的方便將上述結(jié)果均取對數(shù)，相應(yīng)結(jié)果為2.10、2.11、2.10、2.11、2.15、2.10、2.10、2.10、2.10和2.10。金黃色葡萄球菌計數(shù)結(jié)果的對數(shù)算術(shù)平均值為：

4.4 培養(yǎng)基儲存條件產(chǎn)生的不確定度

表1 BP培養(yǎng)基在不同貯存條件下對金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果的影響Table 1 Effect of storage conditions of Barid-Parker culture medium on the enumeration of Staphylococcus aureus

即使由同一廠家生產(chǎn)的Barid-Parker培養(yǎng)基因儲存條件和時間不同，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的檢出率不同[12]。本實驗室按照GB/T 4789.37—2008附錄A.2規(guī)定配制Barid-Parker培養(yǎng)基，在48h內(nèi)對同一金黃色葡萄球菌污染樣品使用不同貯存條件下(室溫和冰柜貯存)的Barid-Parker培養(yǎng)基平板進行了檢測，檢測結(jié)果見表1。

室溫(18～22℃)條件下，金黃色葡萄球菌檢出率算術(shù)平均值為：

4.5 肉眼讀數(shù)的偏差產(chǎn)生的不確定度

對于平板上超過150個菌落，本實驗室檢驗人員通常采用兩種計數(shù)方式：一、直接計數(shù)，即逐個點數(shù)平板上的可疑菌落數(shù)，二、將平板等分四等分，點數(shù)其中一個區(qū)域的可疑菌落數(shù)，再乘以4倍得菌落總數(shù)。本實驗室采用受金黃色葡萄球菌污染的不同樣品進行了20次檢驗，采用上述兩種讀數(shù)方法，檢驗結(jié)果見表2。

表2 不同方法的金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果Table 2 Results of enumeration of Staphylococcus aureus obtained by different colony counting methods

20次不同計數(shù)方式，等分計數(shù)結(jié)果/直接計數(shù)結(jié)果的平均值為：

4.6 血漿凝固酶陽性比例產(chǎn)生的不確定度

由于可疑菌落需要進行血漿凝固酶實驗來最終判定金黃色葡萄球菌的比例，故血漿凝固酶實驗也可產(chǎn)生不確定度。根據(jù)2008年至2009年本實驗室統(tǒng)計，共計完成血漿凝固酶驗證實驗135次，其中1次陽性率為80%，其余驗證結(jié)果陽性率均為100%，則135次驗證實驗金黃色葡萄球菌陽性率平均值為：

單次檢驗的不確定度為：

所以，由血漿凝固酶實驗引入的不確定度為：

4.7 樣品的合成不確定度

4.8 擴展不確定度

在沒有特殊要求的情況下，按一般慣例，測量結(jié)果的擴展不確定度包含因子k取2，則相對擴展不確定度為：

4.9 結(jié)果報告

當(dāng)檢驗結(jié)果以對數(shù)的平均值表示時，其取值區(qū)間分布于±0.21。當(dāng)檢測結(jié)果以平均值表示時，相對于對數(shù)值的取值再取反對數(shù)得其取值區(qū)間分布。

5 結(jié) 論

采用GB/T 4789.37—2008中第一法檢驗水產(chǎn)品中金黃色葡萄球菌，在檢出金黃色葡萄球菌樣品的檢驗結(jié)果中，其對應(yīng)的計數(shù)結(jié)果對數(shù)值的擴展不確定度為0.1。該樣品金黃色葡萄球菌的檢驗計數(shù)結(jié)果為：ω＝10(2.11±0.21)CFU/g，即ω＝(79～209)CFU/g。

經(jīng)過本實驗室對金黃色葡萄球菌檢驗結(jié)果分析得出，按照GB/T 4789.37—2008中第一法中的檢驗方法和實際操作，此次檢驗結(jié)果的不確定度主要來源是：肉眼讀數(shù)的偏差、培養(yǎng)基貯存條件、樣品稱量過程、稀釋過程等因素。

對各不確定度分量進行分析和計算表明，肉眼讀數(shù)偏差產(chǎn)生的不確定度分量最大，其次是培養(yǎng)基貯存條件引入的不確定度，再次是血漿凝固酶驗證實驗和稱量引入的不確定度，相對較小的是樣品稀釋過程和實驗重復(fù)性引入的不確定度。

因此，以后對于樣品金黃色葡萄球菌的檢驗，盡量采用逐個點數(shù)可疑菌落，并在盡可能短的時間內(nèi)使用所配制的Barid-Parker培養(yǎng)基，是確保檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠的有效手段。

[1]雷柞榮. 葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病[M]. 北京: 中國科學(xué)技術(shù)出版社, 1992.

[2]崔京輝, 李達, 王麗萍, 等. 2004-2006年北京市西城區(qū)食品中主要致病菌株檢測結(jié)果及分析[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2008, 18(6): 1163-1165.

[3]許如蘇, 馬少玲, 陳冠武. 奶制品霉菌和酵母計數(shù)檢驗結(jié)果不確定度的評定[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2007, 17(7): 1247-1248.

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[8]中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所. GB/T 4789.1—2008 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 總則[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2009.

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[10]全國流量容量計量技術(shù)委員會. JJG646—2006中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程 移液器[S]. 北京:中國計量出版社, 2007.

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Evaluation of Measurement Uncertainty in the Enumeration of Staphylococcus aureus in Aquatic Products

WANG Li-bao，LING Yun，LIU Lu-ye，SHEN Hui，WAN Xi-he
(Institute of Oceanology and Marine Fisheries, Nantong Jiangsu 226007, China)

To make an evaluation on measurement uncertainty in the enumeration of Staphylococcus aureus in aquatic products, the sources of measurement uncertainty were analyzed, each uncertainty component was modeled and an integrated uncertainty model as a function of all components was established and expanded. The expanded uncertainty was calculated to be 0.1. The evaluation is a good fit for each aquatic product sample.

aquatic products；Staphylococcus aureus；uncertainty evaluation

TS254.1

A

1002-6630(2010)10-0212-04

2009-08-14

江蘇省社會發(fā)展科技計劃(面上)項目(BS2006029)

王李寶(1978—)，男，助理研究員，碩士，主要從事海洋微生物學(xué)研究。E-mail：zebra_w@126.com