酸度計法快速檢測牛奶中殘留的β-內酰胺酶

劉珊珊，周 正，周 巍，張子德，馬俊蓮,*

(1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.河北省食品質量監督檢驗研究院，河北 石家莊 050051)

酸度計法快速檢測牛奶中殘留的β-內酰胺酶

劉珊珊1，周 正2，周 巍2，張子德1，馬俊蓮1,*

(1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.河北省食品質量監督檢驗研究院，河北 石家莊 050051)

為了快速、準確地檢測牛奶制品中殘留的β-內酰胺酶的含量，利用β-內酰胺酶分解青霉素產酸使牛奶pH值下降的原理，對人工添加了β-內酰胺酶的牛奶制品與青霉素反應后pH值的下降規律進行研究。得到牛奶中殘留的β-內酰胺酶與青霉素反應的較適宜條件，從而獲得快速檢測牛奶制品中殘留的β-內酰胺酶的方法。結果確定牛奶制品中殘留的β-內酰胺酶與青霉素反應的適宜條件為溫度33℃、底物質量濃度10mg/mL，檢測時間僅為60min。此方法對液態純牛奶中β-內酰胺酶的最低檢出限為8.92U/mL。

p H值；β-內酰胺酶；牛奶；青霉素；檢測

隨著國家對食品安全問題的關注和部分乳制品企業無抗奶目標的提出，抗生素殘留問題成為影響乳制品安全的重要因素之一[1]。目前，青霉素作為β-內酰胺類藥物是治療牛乳腺炎的首選藥物，是牛奶中最常見的殘留抗生素[2]。由于國內多數乳品企業對抗生素殘留超標的牛乳采取降價收購的原則，出于經濟利益的驅動，一些不法奶站為了謀求自己的經濟利益，人為使用一些生物制劑降解牛乳中殘留的抗生素，生產人造“無抗奶”。

經初步判斷，市售解抗劑的主要成分是β-內酰胺酶，它是由革蘭氏陽性細菌產生和分泌的，可選擇性分解牛奶中殘留的β-內酰胺類抗生素[3]。β-內酰胺酶為我國不允許使用的食品添加劑，該酶的使用掩蓋了牛奶中實際含有的抗生素。β-內酰胺酶能夠使青霉素內酰胺結構破壞而失去活性，導致青霉素、頭孢菌素等抗生素類藥物耐藥性增高，從而大大降低了人們抵抗傳染病的能力，給消費者的身體健康帶來危害[4]。因此，確立針對這種人造“無抗奶”的相應檢測方法、檢測標準，從源頭上監測、把控原奶質量具有十分重要的意義。目前，β-內酰胺酶的檢測方法有間接高效液相色譜法、碘量法，微生物方法[5]和免疫學方法，這些方法存在處理過程相對復雜、費時，不同牛奶樣品實驗現象差別較大，檢出限高等缺點。本研究擬建立采用酸度計檢測牛奶制品中β-內酰胺酶殘留量的便捷方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

青霉素對照品(92.7%)、β-內酰胺酶[446萬U/(mL· h)] 中國藥品生物制品檢定所；無抗奶粉(oxid，按1: 7的質量配比還原成液態牛奶) 市購。

Senven-Multi型pH計 美國Mettler Toledo公司；恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；MS 3 Basic振蕩器 德國IKA公司。

1.2 方法

本實驗的原理是在β-內酰胺酶的作用下，青霉素被水解生成青霉噻唑酸。該酸是一種強酸，可電離產生H+，使牛奶的pH值下降。根據穩態處理米氏方程：v＝K[E][S]/(Km+[S])[6]，式中，v為反應速率、K為反應速率常數、[E]為酶濃度、[S]為底物質量濃度、Km為米氏常數。當酶促反應的底物質量濃度足夠大，即[S]趨向于正無窮時，反應速率與酶的濃度成正比，此時米氏方程變為v＝K[E][7]，這樣就可以利用酸度的變化確定酶催化過程中不同時間段的反應速率，得到酸度變化與酶濃度的關系，從而測定酶的殘留量。

1.2.1 β-內酰胺酶與青霉素底物在牛奶中反應條件的確定

1.2.1.1 適宜的反應溫度的確定

取10mL液態牛奶加入到離心管中，每管加入β-內酰胺酶貯備液使其在奶中的終濃度為100U/mL，振蕩混合均勻，置于10～50℃恒溫水浴鍋中，每個溫度設一個空白對照。將等量青霉素同時加入到空白管和試驗管中，使其終質量濃度為5mg/mL，振蕩混合均勻。使酶與青霉素充分反應，pH值不再發生變化后，計算出ΔpHr=ΔpHβ－ΔpH0，即相對pH變化值等于加入β-內酰胺酶后的pH值變化減去空白管的pH值變化。每個溫度做3個重復，取ΔpHr的平均值，通過ΔpHr的大小篩選出適宜的反應溫度。

1.2.1.2 適宜的反應底物質量濃度的確定

取10mL液態牛奶加入到離心管中，每管加入β-內酰胺酶貯備液使其在奶中的終濃度為100U/mL，振蕩混合均勻，將奶樣置于較適宜反應溫度的恒溫水浴鍋中，分別加入不同量的青霉素儲備液使其終質量濃度從1mg/mL到15mg/mL，使酶與青霉素充分反應，pH值不再發生變化后，測其ΔpHr。每個底物質量濃度重復3次，取ΔpHr的平均值，篩選出較適宜的反應底物質量濃度。

1.2.1.3 反應時間的確定

取10mL液態牛奶加入到離心管中，每管加入β-內酰胺酶貯備液使其在奶中的終質量濃度為100U/mL，振蕩混合均勻，將奶樣置于較適宜反應溫度的恒溫水浴鍋中，每管加入適宜質量濃度的青霉素儲備液，使酶與青霉素充分反應，pH值不再發生變化后，測其ΔpHr，重復3次，取平均值篩選出較適宜的反應時間。

1.2.2 繪制標準曲線，確定最低檢出限

取10mL液態牛奶加入到離心管中，每管加入青霉素貯備液使其在奶中的終質量濃度為10mg/mL，振蕩混合均勻，將奶樣置于較適宜反應溫度的恒溫水浴鍋中，分別加入不同量的β-內酰胺酶貯備液使其終濃度從5U/ mL到140U/mL，使酶與青霉素充分反應，pH值不再發生變化后，測其ΔpHr。每個酶濃度重復3次取ΔpHr的平均值。得到ΔpHr與β-內酰胺酶濃度的變化關系，繪制出標準曲線圖，曲線最低點附近做重復實驗，取平均值得到實驗最低檢出限。

2 結果與分析

2.1 牛奶中β-內酰胺酶催化青霉素水解反應條件的確定

2.1.1 反應溫度的確定

圖1 溫度對酶促反應的影響Fig.1 Effect of temperature on β-lactamase decomposition of penicillin

按照1.2.1.1節的方法，得到ΔpHr隨溫度的變化曲線見圖1。酶在33℃時催化青霉素的活性最高。在10～33℃范圍內，隨著溫度的升高，牛奶中β-內酰胺酶與青霉素反應的速率逐漸增大，即β-內酰胺酶催化青霉素水解的能力逐漸增強。超過33℃后，由于β-內酰胺酶部分失活使其催化能力下降，以及青霉素在較高溫度時自身水解產酸的影響，ΔpHr值減小。經過不同溫度對β-內酰胺酶活力影響的比較，以33℃為適宜的反應溫度。

2.1.2 反應底物青霉素質量濃度的確定

圖2 底物青霉素質量濃度對酶促反應的影響Fig.2 Effect of penicillin final concentration on itsβ-lactamase decomposition

圖2為β-內酰胺酶終濃度為100U/mL時，33℃條件下，ΔpHr值隨底物青霉素質量濃度變化的曲線。由圖2可知，ΔpHr值隨著青霉素質量濃度的增大而增大，當青霉素質量濃度達到10mg/mL時，ΔpHr的值最大，即反應速率最大。繼續增大青霉素質量濃度，ΔpHr值保持基本不變。根據Michaelis-Menten原理，當底物濃度足夠大時，酶的催化速率與底物濃度無關。結果表明，當酶濃度在100U/mL以內，溫度在33℃、底物青霉素質量濃度為10mg/mL時即為足夠大。

2.1.3 反應時間的確定

圖3 pH值隨時間的變化Fig.3 pH change during β-lactamase decomposition of penicillin observed at 10 mg/mL penicillin final concentration and 33 ℃

圖3 為33℃條件下，β-內酰胺酶終濃度為100U/mL，底物青霉素質量濃度為10mg/mL時，牛奶中β-內酰胺酶催化青霉素水解體系pH值變化與時間的關系圖。由圖3可知，當青霉素加入到含有β-內酰胺酶的牛奶中后，pH值隨時間逐漸下降，表明青霉素被牛奶中的酶水解成青霉噻唑酸。當反應60min后，pH值不再下降，保持一個動態平衡，表明反應已經達到平衡。因此，選擇實驗反應時間為60min。

2.2 標準曲線的繪制和最低檢出限的確定

圖4 不同β-內酰胺酶濃度作用下ΔpHr的變化值Fig.4 Standard curve forβ-lactamase determination by the method

標準曲線如圖4所示，方程式為Y=0.0021X－0.0174，R2=0.9856。式中：Y為ΔpHr；X為β-內酰胺酶濃度；R為相關系數。得到理論最低檢出限為8.29U/mL。

理論檢出限附近取點相同條件下測定體系的ΔpHr值，每點做3個平行取平均值，結果見表1。

表1 理論檢出限附近點酶濃度的ΔpHr值Table 1 Average values (3 replicates) of ΔpHrvalues corresponding to βlactamase concentrations close to the theoretical limit of detection

由于pH計本身校準后pH值有±0.005的誤差，所以ΔpHr在±0.005范圍內的檢測值屬于實驗誤差，則由表1可得此方法的實驗實際檢出限為8.92U/mL。

3 結 論

由于分解牛奶中抗生素的β-內酰胺酶是個復雜的酶系[8]，難以用色譜法直接進行準確地檢測分析，目前最多的用于牛奶中β-內酰胺酶的檢測有微生物培養法和碘量法。其中微生物培養法檢出限較低，但是培養時間較長，無法快速檢測。碘量法則檢出限相對較高，且易出現假陽性結果。免疫學方法特異性較強，檢出結果相對準確，但只能定性確定樣品中是否含有β-內酰胺酶而不能確定殘留量。

馬潔等[9]利用此原理研究牛奶中β-內酰胺酶的檢測，用磷酸鹽緩沖液代替牛奶進行酶促反應適宜條件的確定實驗，得到檢出限為15U/mL。本研究利用相同原理，但以市售純牛奶為基本反應體系，酶促反應的較適宜條件，再利用得到的適宜條件繪制標準曲線，得到牛奶中β-內酰胺酶的理論最低檢出限為8.29U/mL，實驗實際檢出限為8.92U/mL，不僅消除了體系不同產生的誤差，更降低了檢出限。由于pH計靈敏度較高，易受到聲波、溫度、水質、振動等外界環境的干擾，為了排除這些干擾因素，在實驗過程中應把不加β-內酞胺酶的空白樣與加了β-內酞胺酶的樣品同時測量，本實驗將pH計的兩個電極接到同一個pH計的兩個檢測模塊上進行測量，減少了系統誤差。平行和重復實驗時應盡量使外界環境因素相同，特別是溫度，應保證每次pH計的顯示溫度與實驗設定溫度相同時再讀數，以降低實驗誤差。

[1]ANONYMOUS. Pasteurized milk ordinance[EB/OL]. (2007-12-06)[2009-09-25]. http://www.cfsan.fda.gov/～ear/pmo03toc.html.

[2]李權超, 王曉光. 長春市生鮮牛乳中抗生素殘留調查報告[J]. 肉品衛生, 1991, 29(3): 67-70.

[3]DAHLM K, RICHARDSONT, BRADLEY L, Jr. Use of microbial beta-lactamase to destroy penicillin added to milk[J]. Dairy Sci, 1985, 68(8): 1910-1916.

[4]鄭穎. TEM-116型超廣譜β-內酰胺酶對牛奶中抗生素的清除[J]. 中國抗生素雜志, 2008, 33(2): 122-124.

[5]崔生輝, 李景云, 馬越. “生鮮牛乳抗生素分解劑”的鑒定與檢測[J]. 中國食品衛生雜志, 2007, 19(2): 113-116.

[6]MICHAELIS L, MENTEN M. Die kinetik der invertinwirkung[J]. Biochem, 1913, 49: 333-369.

[7]BRIGGS G E, HALDANE J B. A note on the kinetics of enzyme action [J]. Biochem, 1925, 19: 339-339.

[8]呂媛, 李家泰, 單愛蓮. β-內酰胺酶抑制劑與β-內酰胺酶類抗生素聯合應用的抗菌作用評價[J]. 中國臨床藥理學雜志, 1998, 14(1): 53-57.

[9]馬潔, 李孝君. 利用酸度計檢測奶制品中殘留的β-內酰胺酶[J]. 化學通報, 2009, 72(4): 370-373.

Use of An Acid Meter for the Rapid Determination of β-Lactamase Residue in Milk

LIU Shan-shan1，ZHOU Zheng2，ZHOU Wei2，ZHANG Zi-de1，MA Jun-lian1,*
(1. College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China；2. Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Shijiazhuang 050051, China)

The principle that β-lactamase selectively decomposes β-lactam antibiotics like penicillin into acids leading to pH decline was considered to present a rapid and accurate method for the determination of β-lactamase residue in milk. β-Lactamase at a constant final concentration of 100 U/mL and penicillin were artificially added to antibiotic free milk and left to react for a certain period of time at an appropriate temperature. The optimal penicillin final concentration and reaction time and temperature were determined to be 10 mg/mL, 60 min and 33 ℃, respectively. The developed method exhibited a limit of detection of 8.92 U/mL.

pH value；β-lactamase；milk；penicillin；determination

Q5；TS207.3

A

1002-6630(2010)10-0216-03

2009-10-26

河北省科學技術研究與發展計劃項目(09227114D)

劉珊珊(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為農產品貯運原理與技術。E-mail：qhdlss1985@sina.com

*通信作者：馬俊蓮(1965—)，女，教授，博士，研究方向為農產品采后生物技術。E-mail：zhangzde@heinfo.net