頂空固相微萃取法測定哈密瓜中揮發性芳香成分研究

賈 愷，胡小松，廖小軍，張名位，陳 芳，吳繼紅,*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，農業部果蔬加工重點開放實驗室，教育部果蔬加工工程研究中心，北京100083；2.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東 廣州 5 10610)

頂空固相微萃取法測定哈密瓜中揮發性芳香成分研究

賈 愷1，胡小松1，廖小軍1，張名位2，陳 芳1，吳繼紅1,*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，農業部果蔬加工重點開放實驗室，教育部果蔬加工工程研究中心，北京100083；2.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東 廣州 5 10610)

采用頂空固相微萃取(HS-SPME)方法研究哈密瓜汁中揮發性芳香成分(VFC)，對電解質(鹽)、萃取溫度、萃取時間進行單因素和正交試驗。結果表明：應用PDMS/DVB/CAR(聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯/碳分子篩) 50/30μm萃取頭，8mL哈密瓜汁中加入2.4g飽和電解質NaCl，在40℃萃取40min，哈密瓜GC譜圖峰面積最大，VFC萃取和檢測效果最好；該方法加標回收率為86.8%～97.6%，線性范圍8.24～217ng/mL，最小檢測限7.21ng/mL，方法靈敏度和重現性好。哈密瓜中主要的VFC為乙酸乙酯、乙酸丙酯、2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯和壬醛等。

頂空固相微萃取；正交試驗；揮發性芳香物質；哈密瓜

哈密瓜(Cucumis melon. var. recticulatus. Hamimelon)誘人的香氣成分是其產品品質重要的評價指標[1-6]。哈密瓜屬熱敏性瓜果，在加熱處理數分鐘后其香氣成分便損失殆盡，且產生令人不愉快的蒸煮味，完全失去了其

原有的風味品質特征，因此哈密瓜熱加工中的變味問題引起了風味研究者的關注，成為該領域研究熱點和難點。

采用不同提香方法會產生不同的分析結果。1971年Kemp等[7]在用減壓蒸餾法提取的風味濃縮物中檢出了大量的九碳醇類和醛類，只發現極微量的酯類和苯甲醛。1997年宛曉春等[8]采用Amberlite XAD-2吸附新疆伽師瓜香氣，得到13種成分，主要是醇、醛、酮，酯類僅有2種，認為3,6-壬二烯醇、6-壬烯醇、苯甲醇及呋喃類物質是哈密瓜風味的主體成分。2004年馬永昆等[9]采用固相微萃取方法對不同成熟度金皇后甜瓜汁的香氣進行富集，得到45種成熟金皇后甜瓜的揮發成分，初步確定9種成分為金皇后甜瓜的特征香氣。

SPME方法應用于哈密瓜香氣成分的研究相對較少，缺少SPME方法實驗參數的系統研究。在馬永昆研究工作基礎上，結合HS-SPME-GC-MS技術對伽師瓜果汁香氣成分的實驗參數加以探討、優化并對其可行性加以分析，確定出最佳萃取條件，并對哈密瓜果汁揮發性芳香物質進行了系統分析和鑒定，以期建立快速、穩定、高效的檢測手段和技術，為今后建立不同品種哈密瓜香氣的色譜圖庫、科學評價鑒定哈密瓜的香氣品質以及哈密瓜變味機理的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

伽師瓜[哈密瓜(Hami Melon)的一種]采自新疆吐魯番地區，選取大小和果色一致的果實，取果肉榨汁，200目濾網過濾，－1 8℃凍藏。

庚醇、辛醛、壬醛、檸檬烯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸己酯、己酸丁酯(標準品，色譜純)上海愛普香料有限公司；乙酸乙酯(色譜純，純度大于99.5%)；以上標準品均用甲醇(色譜純)分別配成一定濃度的儲備液備用；氯化鈉(分析純)。

1.2 儀器與設備

手動SPME進樣器 美國Supelco公司；HP5973氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent 公司；SP-3400氣相色譜 北京分析儀器廠；榨汁機 上海燦坤電器公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME操作

SPME 頂空萃取：選取大小和果色一致的果實3個(約9kg)，去皮榨汁并過濾待用。取果汁8mL放入15mL樣品萃取瓶中，加入2.4g氯化鈉，使其質量濃度為0.3g/mL，內標及磁力轉子置于固相微萃取工作臺上預熱10min；將固相微萃取器的聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯/碳分子篩(Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene/ Carboxen，PDMS/DVB/CAR)萃取頭通過瓶蓋聚四氟乙烯隔墊插入樣品萃取瓶的頂空，推出吸附頭使其暴露于萃取瓶頂空蒸汽中進行萃取。當樣品萃取平衡后，縮回纖維頭，迅速將針管插入氣相色譜儀的進樣口，推出纖維頭熱解析3min，同時啟動氣相色譜儀采集數據。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：HP-5毛細管柱(25m×0.2mm，0.11μm)；升溫程序：40℃保持2min，以4℃/min 升至75℃，以1℃/min 升至80℃，以10℃/min升溫至230℃，保持3min；載氣(N2)流速1.0mL/min。進樣器溫度250℃；檢測器溫度250℃，無分流進樣。以色譜峰保留時間定性，以內標法定量計算。

1.3.3 質譜條件

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度250℃；質量掃描范圍m/z 15～500。

1.3.4 定性定量

定性：利用GC-MS進行定性，通過計算機檢索與NIST02質譜庫提供的標準質譜圖對照，并參照文獻[7]、[9]進行確認。

定量：數據處理采用BF2002 色譜工作站軟件。選擇庚醇為內標，使其在哈密瓜果汁中的質量濃度為20.4ng/mL，以哈密瓜果汁中代表性的香氣物質測定它們對庚醇的響應因子。哈密瓜果汁中鑒定出的醇類、酯類和醛類物質的質量濃度以相應的真實物質或結構相近的物質的相對響應因子計算。

根據方法的設計原理，SPME加熱溫度、萃取時間、鹽添加量被認為是影響目標化合物在萃取膜上的萃取效率[10]的主要因素。本實驗對上述條件進行三因素三水平的正交試驗，以峰面積為判定指標進行直觀分析；在此優化條件基礎上，進行方法線性范圍、回收率、檢出限等實驗。每個處理進行3次平行實驗，測定結果取其平均值。

2 結果與分析

2.1 哈密瓜果汁萃取條件研究

2.1.1 SPME萃取效果單因素試驗

2.1.1.1 鹽效應對萃取效率的影響

本實驗對添加電解質——飽和NaCl溶液(2.4g N aCl，即0.3g/mL)、半飽和NaCl溶液(1.2g NaCl，即0.15g/mL)和不加NaCl溶液的哈密瓜果汁進行了對比。

由圖1可以看出，除丁酸乙酯外，加入飽和電解質NaCl溶液的樣品各組分的萃取量明顯高于半飽和NaCl溶液和不加NaCl溶液的樣品，所以實驗過程中采用NaCl用量為2.4g。當往液態基體中加入NaCl等鹽類物質時可以增大溶液的離子強度，降低基體對揮發性物質的束

縛，提高其中有機物的逸出活度，促進其從液態基體中揮發出來，吸附到纖維頭上，從而降低了該方法的檢測限，提高香氣成分的響應值。從圖中還可以看出，除了丁酸乙酯外，隨著NaCl用量增大，大部分香氣成分萃取效果明顯提高，說明不同的揮發性物質其揮發性對NaCl的用量存在著差異。

圖1 不同用量NaCl的萃取效應Fig.1 Effect of NaCl amount on the extraction of 5 volatile compounds using a PDMS/DVB/CAR fiber

2.1.1.2 萃取溫度的確定

固定采樣時間和氣相色譜條件的情況下，萃取溫度對吸附效果的影響如圖2所示。實驗比較了20、30、40、50、60℃不同溫度條件下對萃取效果的影響，由圖2可知，升高溫度可以增強香氣成分的萃取效果，但當溫度超過50℃時，乙酸乙酯萃取量呈下降的趨勢，而壬醛、庚醇、檸檬烯還未達到吸附平衡。這是因為不同的香氣成分具有不同的物化性質，所以吸附的難易程度不同，達到吸附平衡的時間也不同。操君喜等[11]對哈密瓜進行70℃熱處理后，經鑒定全為C8～C40的烷烴類化合物，表明其風味物質全部喪失。考慮到升高溫度可能會引起哈密瓜果汁中香氣物質發生化學變化，所以適宜的萃取溫度為30～40℃。

圖2 萃取溫度對萃取量的影響Fig.2 Effect of temperature on the extraction of 5 volatile compounds using a PDMS/DVB/CAR fiber

2.1.1.3 萃取時間的確定

實驗發現，當萃取溫度保持不變時，隨著萃取時間的延長，哈密瓜果汁中各組分的含量不斷上升，如圖3所示。但是當萃取時間超過40min后，壬醛、乙酸乙酯的萃取效果呈下降趨勢，這是因為隨著時間的延長，吸附在纖維頭上易揮發的物質得到解析。同時，由于時間的延長，果實中自由水和結合水的蒸發析出，使纖維頭凝結水滴，從而大大降低了纖維頭對揮發性芳香物質的吸附。所以最佳吸附時間為30～40min。

圖3 萃取時間對萃取效果的影響Fig.3 Effects of extraction time on the extraction of 5 volatile compounds using a PDMS/DVB/CAR fiber

2.1.2 哈密瓜果汁最佳萃取參數的確定

采用L9(33)正交試驗，確定SPME萃取哈密瓜果汁芳香成分的最佳參數。選擇SPME萃取溫度(A)、萃取時間(B)、電解質NaCl的用量(C)3個因素，其因素水平設計見表1。

表1 L9(33)正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

表2 正交試驗結果Table 2 Arrangement and experimental results of the orthogonal array design

由表2 可知，各因素影響主次順序為C＞B＞A，

較優水平組合為A2B3C3。最終確定最佳試驗條件為加入2.4g飽和電解質NaCl(即0.3g/mL)，40℃萃取40min。

2.1.3 SPME萃取方法精密度和準確度的測定

2.1.3.1 標樣回收率的測定

定量分析采用內標法，根據萃取后樣品中待測組分與內標之間的關系：Coi=FisACosAi/As，(Coi待測組分含量；FisA峰面積定量相對響應因子；Cos內標物含量；Ai待測物質峰面積；As內標物峰面積)若內標物的含量恒定，則FisACos/As恒定，待測組分含量與其峰面積成正比。選取2-甲基丁酸乙酯、辛醛、乙酸己酯、己酸丁酯制成標準物質混合液加入到果汁中，用SPME方法測得其加標回收率為86.8%～97.6%，如表3 所示，說明方法準確結果可靠。

2.1.3.2 線性范圍和最小檢出限的測定

分別取5個質量濃度梯度的標準物質混合液，其中均含有20.4ng/mL庚醇內標物。分別加入到脫香果漿中[12]，采用SPME與GC分析計算出各組分在8.24～217ng/mL測量質量濃度范圍內，峰面積與質量濃度呈線性關系，最小檢測量為7.21ng/mL。各標樣標準曲線回歸方程均呈現一次線性，回歸方程中系數a、b及回歸系數R2如表3所示。

表3 標樣回收率及回歸方程系數Table 3 Recoveries for ethyl 2-methylbutyrate, octanal, hexyl acetate and n-butyl acetate

2.2 哈密瓜VFC的GC-MS測定

圖4 哈密瓜果汁揮發性芳香物質SPME-GC-MS總離子色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of volatile components of Jiashi muskmelon obtained by optimized HS-SPME

應用上述得到的HS-SPME-GC-MS最佳操作條件，對哈密瓜果汁GC-MS 分析的總離子色譜圖如圖4所示。可以看出，各種香氣成分的峰尖且窄，相鄰峰均完全得到分離，說明實驗用氣相色譜和質譜條件能滿足哈密瓜香氣成分分離的要求。

表4 哈密瓜果汁揮發性芳香物質SPME-GC-MS分析成分一覽表Table 4 Volatile composition in Jiashi muskmelon analyzed by the developed SPME/GC-MS method

采用固相微萃取技術分析哈密瓜果汁中的香氣成分，只需少量的原料即可得到滿意的結果。哈密瓜香氣成分的色譜圖上共鑒定出了42 個揮發性芳香化合物，見表4。按峰面積計算，其含量占哈密瓜果汁揮發性成分的93%。它們由酯類、醇類、醛類和烯烴構成，其中酯類有2 8種，醇類有5種，醛類有5種，烯烴類有3種，酸類1種。伽師瓜果汁香氣成分的峰面積占79.95%的是酯類，醇類占7.64%，醛類占2.94%和烯烴占2.50%。與文獻[9]報道的哈密瓜芳香成分鑒定結果相比，主要揮發性芳香物質組成基本一致。這些成分呈現出的似蜜香、花香、果香、醇香和清鮮香氣混合組成了伽師瓜獨特的香氣。根據Guadagni 的香氣值理論和已知化合物的香氣閾值[13-15]，哈密瓜香氣成分中峰面積大且香氣閾值低的成分對香氣的影響較大，它們很可能是特征香氣。乙酸乙酯、乙酸丙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、2-甲基丙酸乙酯和 2-甲基丁酸乙酯、壬醛是伽師瓜的主要香氣成分，占酯類峰面積50.7%的乙酸酯類對構成伽師瓜的香氣有關鍵作用[16]。

馬永昆等[9]采用SPME 方法應用PDMS萃取頭檢測了哈密瓜汁中的香氣成分，其中酯類有33種，醇類4種，醛類2種。本實驗使用PDMS/DVB/CAR 50/30μm萃取頭對哈密瓜中的香氣成分進行富集，其中酯類有28種、醇類5種、醛類5種、烯烴類3種、酸類1種。結果表明PDMS/DVB/CAR 三相復合萃取頭比單一極性的PDMS萃取頭具有更寬的極性范圍和更好的萃取效果。操君喜等[11]從哈密瓜樣品中鑒定了12種成分，相對體積分數最多的是呋喃類物質，酮類和酸類分別占17%和23%，確定酯類及呋喃醇是哈密瓜香味的主體成分。本研究的揮發性成分在種類和數量上與馬永昆有較大的差別，檢測手段的進步和品種的不同都可能是產生這種差異的原因。

國內關于SPME方法應用于哈密瓜香氣成份的文獻中缺少對方法實驗參數的系統研究。本實驗結合HSSPME-GC-MS技術對伽師瓜果汁香氣成分的實驗參數萃取溫度、萃取時間、鹽添加量進行正交試驗，以峰面積為判定指標進行直觀分析；并在此優化條件基礎上，進行方法線性范圍、回收率、檢出限等實驗，較為系統的建立了一個SPME應用于哈密瓜香氣成份分析的方法。本研究使用GC-MS鑒定哈密瓜果汁揮發性芳香物質并根據Guadagni的香氣值理論和已知化合物的香氣閾值進行了系統分析。

但是GC-MS作為一種間接的測量方法，并不能用來有效分析出所有香味活性的化合物，此外，GC-MS無法用來確定各種香味化合物對哈密瓜總體香味貢獻的大小，因而也就無法確定對哈密瓜香味起作用的一些關鍵香味化合物。氣相色譜-嗅聞技術(GC-O)是解決這些問題的一種理想的方法，在SPME方法的基礎上結合GC-O技術鑒別哈密瓜特征香味化合物及確定哈密瓜香味化合物的香味強度和作用是今后研究的重點。

3 結 論

確定了H S-S P M E哈密瓜風味物質分析中應用PDMS/DVB/CAR 50/30μm萃取頭，加入飽和電解質NaCl 2.4g(即0.3g/mL)，在40℃萃取40min，GC譜圖峰面積最大，哈密瓜VFC萃取和檢測效果最好。

該方法加標回收率在86.8%和97.6% 之間，線性范圍、最小檢測限分別為8.24～217ng/mL和7.21ng/mL，方法操作靈敏性和重現性好。

哈密瓜果汁HS-SPME-GC-MS 研究表明，主要的VFC 包括醛類、醇類、酯類和烯烴類化合物等，在已鑒定的42個化合物中乙酸乙酯、乙酸丙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、2-甲基丙酸甲酯、2-甲基丙酸乙酯和 2-甲基丁酸乙酯等為主要的呈香物質。

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Headspace Solid-phase Microextraction Followed by GC-MS Analysis of Volatile Flavor Composition of Hami Melon

JIA Kai1，HU Xiao-song1，LIAO Xiao-jun1，ZHANG Ming-wei2，CHEN Fang1，WU Ji-hong1,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Key Laboratory of Fruits and Vegetables Processing, Ministry of Agriculture, Engineering Research Centre for Fruits and Vegetables Processing, Ministry of Education, Beijing 100083, China；2. Sericulture and Agro-processing Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510610, China)

The optimal conditions (namely NaCl amount and extraction temperature and time) for the headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) of volatile flavor components from Jiashi muskmelon, one cultivar of Hami melon were investigated by single factor and orthogonal array design methods. The optimized HS-SPME was coupled with GC-MS to develop a method for the analysis of volatile flavor composition of Jiashi muskmelon. Results showed that the use of a PDMS/DVB/CAR fiber for the 40 min extraction at 40 ℃ of Jiashi muskmelon with NaCl added as electrolyte at 2.4 g/mL gave an optimal extraction of volatile flavor components from Jiashi muskmelon. The developed analytical method exhibited spike recoveries for ethyl 2-methylbutyrate, octanal, hexyl acetate and n-butyl acetate varying from 86.8% to 97.6%, a liner range from 8.24 to 217 ng/mL and a minimum detectable quantity of 7.21 ng/mL and demonstrated high sensitivity and reliability. Forty-two compounds were identified in Jiashi muskmelon, in which, the predominant compounds were ehyl aetate, n-popyl acetate, popanoic acid, 2-methyl-, ethyl ester, btan oic acid, ethyl ester, btanoic acid, 2-methyl-,ethyl ester, hxanoic acid, ethyl ester, aetic acid, hexyl ester and nonanal.

headspace solid-phase microextraction (HS-SPME)；orthogonal array design；volatile flavor compound (VFC)；Jiashi muskmelon

TS255.2

A

1002-6630(2010)10-0239-05

2009-08-03

賈愷(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為風味化學。E-mail：tjujiakai@gmail.com

*通信作者：吳繼紅(1964—)，女，副教授，博士，研究方向為風味化學。E-mail：wjhcau@yahoo.com.cn