雜色曲菌素HPLC檢測方法的建立及其在大米污染樣品中的運用

譚輝勇，方明英，王衡馨，姚冬生，劉大嶺*

(暨南大學微生物技術研究所，廣東 廣州 510632)

雜色曲菌素HPLC檢測方法的建立及其在大米污染樣品中的運用

譚輝勇，方明英，王衡馨，姚冬生，劉大嶺*

(暨南大學微生物技術研究所，廣東 廣州 510632)

采用自制雜色曲菌素(VA)標準品，建立大米中雜色曲菌素的高效液相色譜檢測方法。大米污染樣品經丙酮提取、柱色譜凈化，HPLC-紫外檢測器進行測定，檢測波長288nm。結果表明，VA在100～1250ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好，r＞0.999，方法回收率在84.12%～105.12%之間，平均變異系數小于7.5%，最低檢測限為50ng/mL。該方法靈敏度較高、穩定性好、成本較低，可以用于糧食中雜色曲菌素的定量檢測。

雜色曲菌素；高效液相色譜；柱色譜法；紫外檢測器

雜色曲菌素(VA，versicolorin A)又稱1,6,8-三羥基-2-羥甲基蒽醌，它是黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)及雜色曲霉素(sterigmytocystin，ST)合成代謝過程中的重要前體物，其結構含有與AFB1和ST相同的毒性基團——雙呋喃環[1-2](圖1)。早在20世紀80年代，Wong等[3-5]就對VA的急性毒性和致畸變性做了初步研究，其LD50(小鼠靜脈注射)為20mg/kg，致突變劑量(ames test)為800ng/皿，因而雜色曲菌素的毒性不容忽視。目前，國內外對糧食和飼料中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的危害相當重視，發展了很多高靈敏的分析檢測方法[6-7]，但對雜色曲菌素的污染和檢測關注不足，未列為法定的檢測內容，相應的H P L C分析檢測方法僅見McCormick等少數的報道[8-9]，主要以TLC方法[10-12]為主，該法靈敏度不高，可靠性也不強。本研究通過對寄生曲霉誘變菌株的培養，分離純化、制備VA的標準品，建立雜色曲菌素的HPLC分析檢測方法，并對污染的大米樣品進行檢測運用，探索適合糧食中VA檢測的分析方法。

圖1 AFB1、ST和VA化學結構式Fig.1 Chemical structure of AFB1, ST and VA

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

寄生曲霉突變菌ATCC 36537 ATCC公司；寄生曲霉突變菌野生菌GIM3395 中國科學院廣東微生物研究所；大米 市購。

丙酮、石油醚、正己烷、甲醇、乙醚、二氯甲烷均為AR級，其中用于高效液相色譜儀的試劑均為色譜純。培養基所需成分(參照菌種說明)購自廣州市環出凱微生物科技有限公司；VA(純度99.99%)。

UFLC系列半制備型高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器) Shimadiu公司；1100系列質譜儀 Agilent公司；旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；arium 611超純水系統 Sartorius公司；冷凍干燥儀 Lishin公司。

1.2 方法

1.2.1 VA標準品的制備

1.2.1.1 突變菌株的培養

將寄生曲霉突變菌ATCC 36537接種于MEA液體培養基中，24℃黑暗靜止培養5d，然后取適量活化后的菌株接入YES培養基24℃黑暗靜止培養約10d左右。

1.2.1.2 VA的提取

收獲培養好的菌絲體，100℃滅菌15min，充分搗碎，加入足量的丙酮提取，收集丙酮提取液，5 0℃旋轉蒸發儀蒸干，加入250mL 體積分數50%的丙酮溶液溶解，轉移到分液漏斗中，用100mL石油醚萃取3次，去掉部分雜質，然后加入100mL正己烷萃取3次，收集正己烷層，5 0℃旋轉蒸發儀蒸干，溶于適量甲醇備用。

1.2.1.3 VA的純化制備

采用半制備型高效液相色譜儀進行純化。儀器條件：柱子：Shim-pack PRC-ODS(20mm×250mm，15μm)；流動相為甲醇-水；洗脫程序為0～30min由95%的甲醇溶液逐步變化為100%的甲醇；流速：4mL/min；進樣量：1mL；檢測波長為288nm。

1.2.1.4 VA的LC-MS鑒定

儀器條件：柱子：Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；保護柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×12.5mm，5μm)；柱溫：40℃；質譜條件：ESI離子源；離子極性：陰性；掃描范圍：50～500u；霧化氣壓：40psi；干燥氣流速：12.0L/min；干燥氣溫度：350℃；碰撞能量：自動MS/MS：1.0V；選擇反應監測：1.0V；目標質量：350u；化合物穩定性：50%；離子阱驅動水平：100%；掃描1：－60.8V；掃描2：－6.0V；八級桿射頻振幅：150.0Vpp；錐型體1：5.0V；錐型體2：60.0V；毛細管出口：－148.7V；毛細管出口補償：－87.9V；目標：30000；自動質譜/質譜閾值：10000；氮氣：99.5%；氦氣：99.9995%；MS/MS同時記錄總離子流色譜圖。

1.2.1.5 紫外特征吸收檢測及純度分析

檢測條件：柱子：SHIMADIU ODS-C18(4.6mm× 150mm，5μm)；流動相為10mmol/L醋酸銨-20μmol/L乙酸鈉溶液(A)和10mmol/L醋酸銨-20μmol/L乙酸鈉甲醇溶液(B)，采用梯度洗脫(洗脫程序設定見表1)；流速：0.3mL/min；進樣量10mL；二極管陣列檢測器，檢測波長為288nm。方法參照文獻[13]方法并加以改進。

表1 紫外特征吸收檢測梯度洗脫程序Table 1 HPLC gradient elution program for VA analysis

1.2.2 大米樣品中VA的檢測

將大米在紫外燈下用無菌雙蒸水浸泡1h，然后分裝于27個預先滅好菌的培養皿(20g/皿)中，向其中24個培養皿中分別接入1mL 1×106CFU/mL的寄生曲霉突變菌野生菌GIM3395孢子懸液(用Tween-80配制)，另外3個培養皿做為空白對照。28℃，相對濕度80%的條件下避光靜止培養2 0 d，第3、5、7、1 0、1 1、1 4、

17、20天分別各取3個皿，按下述方法提取、凈化和檢測。

1.2.2.1 VA的提取

將20g大米樣品粉碎，用足量的丙酮提取，將丙酮提取液通過無水硫酸鈉過濾，旋轉蒸發儀蒸干，加入50mL體積分數50%的丙酮溶液溶解，轉移至分液漏斗中；50mL石油醚萃取3次，丟棄石油醚層；在剩下的丙酮溶液層中，加入50mL正己烷萃取3次，收集正己烷層；將收集好的正己烷層于－20℃冰箱中過夜，過濾[14](可除去少量油脂)，蒸干后溶于4mL甲醇，4℃避光保存備用。

1.2.2.2 VA的凈化

采用硅膠吸附柱進行樣品凈化。分別稱量5g(200～300目)硅膠、1g(100～200目)硅膠、4g無水硫酸鈉110℃活化2h，冷卻至70℃左右后于干燥器中保存備用。在15mm×300mm的層析柱中先加入石油醚10mL，然后加入2g無水硫酸鈉，用玻棒輕輕攪動，排出無水硫酸鈉層內的氣泡。然后在裝有5g(200～300目)硅膠吸附劑的燒杯中加入15mL石油醚，用玻棒輕輕攪動，使硅膠懸浮，同時打開層析柱下口活塞，使柱內石油醚緩慢流出，將懸浮的硅膠吸附劑移入柱中。當硅膠吸附劑自然下沉，石油醚液面下降至硅膠吸附劑上方3～4cm時，關閉活塞，加入吸附有待凈化樣品的100～200目硅膠1g (干法上樣)，再加入無水硫酸鈉2g，然后依次按照下列溶劑洗脫：石油醚10mL，乙醚-正己烷(4:6，V/V)10mL，二氯甲烷-丙酮(9:1，V/V)20mL，收集第3步洗脫劑，旋轉蒸發儀蒸干，溶于1 mL甲醇，待測。

1.2.2.3 VA的檢測

檢測條件同標品制備中的純度分析。

1.2.2.4 方法的回收率、精密度、線性范圍和檢出限

向未檢出VA的大米空白樣品中加入雜色曲菌素標準溶液測定回收率；重復9次計算精密度[15]；通過測定不同質量濃度的雜色曲菌素標準溶液(1 0 0、2 0 0、500、750、1000、1250ng/mL)確定線性范圍；信噪比按RSN＞3計[16]，可得雜色曲菌素的檢出限。

2 結果與分析

2.1 VA標準品的制備與純化

圖2 VA標準品的制備分離圖譜Fig.2 Semi-preparative HPLC chromatogram for VA purification

通過半制備高效液相色譜對粗樣品進行分離(圖2)，收集保留時間為30.551min的目的峰，不斷重復累積，最后冷凍干燥，采用精度為0.001mg的電子天平稱量，獲得了大約0.6mg VA標準品。

2.2 LC-MS鑒定

圖3 VA標準品的一級離子質譜圖Fig.3 Mass spectrum of the VA prepared in our laboratory

從質譜圖(圖3)來看，本實驗室制備的VA標準品相對分子質量為338，質荷比(m/z)為337，并且未見其他雜質峰，與國外Hamasaki等[17]報道的結果一致。

2.3 VA標準品的純度分析及紫外特征吸收檢測

用分析型高效液相色譜分析上述的VA標準品，檢測表明無其他雜質峰出現(圖4)，目的峰純度達到99.99%，并且其在波長288nm處有明顯的紫外特征吸收(圖5)。

圖4 VA標準品的色譜純度分析Fig.4 Analytical HPLC chromatogram of the VA prepared in our laboratory

圖5 VA標準品的紫外特征吸收圖譜Fig.5 UV absorption spectrum of the VA prepared in our laboratory

2.4 標準曲線的制作

在測定的質量濃度范圍(100～1250ng/mL)內，VA的質量濃度與峰面積具有較好的線性關系，經計算得到其線性回歸方程為y = 0.0212x+13.477，相關系數R=0.99932。工作曲線見圖6。

圖6 VA的定量標準曲線Fig.6 Standard curve of VA

2.5 回收率、精密度和檢測限

在已知不含VA的20g大米對照品中，分別加入600、800、1100ng標準品，每個劑量設3個平行，按1.2.2節中的方法提取，凈化和測定VA的含量，計算回收率及變異系數，結果見表2。由表可知，平均回收率為94.59%，平均變異系數為7.45%。該方法檢測VA的最低檢測限為50ng/mL(RSN＞3)。

表2 方法回收率和精密度測定Table 2 Average recoveries of 3 replicates of VA in a blank rice sample spiked at 3 levels

2.6 大米污染樣品的檢測

圖7 大米污染樣品(培養7d)的檢測圖譜Fig.7 Analytical HPLC chromatogram of rice artificially contaminated with Aspergillus parasiticus GIM3395 (cultivated for 7 days)

用上述HPLC方法對被寄生曲霉污染的大米樣品進行檢測，VA均能很好的在23.2min左右出峰，其分析圖譜見圖7。

檢測發現，被寄生曲霉污染的大米在培養的第3天即可檢出VA，在24個樣品皿中，陽性檢出率100%，對照組未檢出VA(表3)。

表3 VA在大米污染樣品中不同培養時間段的檢測結果Table 3 Results of determination of VA in rice artificially contaminated with Aspergillus parasiticus GIM3395 at different cultivation time points

3 結 論

本實驗通過半制備高效液相色譜分離，純化和LCM S鑒定，制備了V A標準品，該方法簡便、快捷，不需要煩瑣的樣品前處理過程，并且制備的標準品純度較高，足以滿足一般的研究需求。另外，采用自裝硅膠柱成功地對污染了寄生曲霉的大米樣品進行凈化，并且保持了較高的回收率、達到良好的凈化效果。整個方法具有良好的重現性，檢測限為50ng/mL，平均回收率達到94.59%，同TLC法相比較，更加靈敏、可靠。由于VA是黃曲霉毒素和雜色曲霉素的重要前體物，VA

的高量檢出可能會意味著黃曲霉毒素或雜色曲霉素(依污染菌種而不同)污染的潛在危險。在實際樣品中的VA污染情況的調查研究正在進行之中。

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HPLC Determination of Versicolorin A in Aspergillus parasiticus Contaminated Rice

TAN Hui-yong，FANG Ming-ying，WANG Heng-xin，YAO Dong-sheng，LIU Da-ling*
(Institute of Microbial Biotechnology, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

A HPLC method was established for the determination of versicolorin A (VA) in Aspergillus parasiticus contaminated rice using the VA prepared in our laboratory as a

tandard, which was prepared from the fermented mycelia of Aspergillus parasiticus ATCC 36537 through organic solvent extraction followed by semi-preparative HPLC purification. Samples (like rice artificially contaminated with Aspergillus parasiticus GIM 3395 in this study) were extracted with acetone, cleaned up on a silica column and analyzed using a HPLC system equipped with a UV detector at 288 nm wavelength. Results showed that the standard curve of VA exhibited good linearity over the concentration range of 100 to 1250 ng/mL with more than 0.999 correlation coefficient. Average recoveries of 3 replicates of VA in a blank rice sample spiked at 3 levels were between 84.12% and 105.12% with an average relative standard deviation of less than 7.5%. The limit of detection was 50 ng/mL. This method proved to be sensitive, stable and economical and thus is most suitable for the quantification of VA in cereal grains.

versicolorin A；high performance liquid chromatography (HPLC)；column chromatography；UV detector

TS207.3；O657.72

A

1002-6630(2009)10-0254-05

2009- 11-18

譚輝勇(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為分子酶學與酶工程。E-mail：tanhuiyong253@163.com

*通信作者：劉大嶺(1963—)，女，教授，博士，研究方向為微生物學。E-mail：tldl@jnu.edu.cn