高效液相色譜法測定雞組織中尼卡巴嗪標(biāo)識殘留物

謝守新，林海丹，姚仰勛，邵琳智，吳映璇

(1.廣州出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623；2.廣東檢驗檢疫技術(shù)中心食品實驗室，廣東 廣州 510623)

高效液相色譜法測定雞組織中尼卡巴嗪標(biāo)識殘留物

謝守新1，林海丹2，姚仰勛2，邵琳智2，吳映璇2

(1.廣州出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623；2.廣東檢驗檢疫技術(shù)中心食品實驗室，廣東 廣州 510623)

應(yīng)用高效液相色譜法測定雞組織中尼卡巴嗪標(biāo)識殘留物——4,4＇-二硝基均二苯脲。試樣經(jīng)乙腈-0.5g/mL氫氧化鉀溶液提取，正己烷脫脂凈化，用高效液相色譜儀(C18柱)分析，流動相為乙腈-體積分?jǐn)?shù)1%乙酸溶液(53:47，V/V)，流速1.0mL/min，紫外檢測波長為350nm。對雞肉、雞肝和雞蛋樣品進(jìn)行0.05～0.50mg/kg的藥物添加回收實驗，4,4＇-二硝基均二苯脲的平均回收率為93.6%～102.0%(n=10)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～10.4%，方法的定量限為0.05mg/kg。該法簡便、準(zhǔn)確，適用于雞組織中尼卡巴嗪標(biāo)識殘留物4,4＇-二硝基均二苯脲的檢測。

雞組織；尼卡巴嗪標(biāo)識殘留物；4,4＇-二硝基均二苯脲；高效液相色譜法

尼卡巴嗪(nicarbazin)為4,4＇-二硝基均二苯脲(DNC)與2-羥基-4,6-二甲基嘧啶(HDP)組成的復(fù)合物，是目前養(yǎng)禽業(yè)中最常使用的抗球蟲藥之一，對球蟲又有抑制合殺滅作用。其廣譜、低毒、安全，但在高用藥水平下，也會發(fā)生細(xì)胞變異，肝臟腫脹，極少數(shù)雞發(fā)生脾臟壞死和軟骨病癥。由于羥基二甲基嘧啶在動物給藥后，其吸收及其代謝比4,4＇-二硝基均二苯脲快得多，4,4＇-二硝基均二苯脲成為研究尼卡巴嗪可能殘留的關(guān)注標(biāo)識物。我國及聯(lián)合國糧農(nóng)組織、新西蘭、日本均以4,4＇-二硝基均二苯脲單體作為尼卡巴嗪的殘留標(biāo)識物。

我國規(guī)定雞組織中尼卡巴嗪標(biāo)識殘留物最大殘留限量為0.2mg/kg，國際食品法典委員會規(guī)定雞組織中為0.2mg/kg，加拿大規(guī)定雞可食用組織為4.0mg/kg，日本肯定列表中規(guī)定雞肉為0.2mg/kg。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和新西蘭規(guī)定禽肉中最大殘留限量分別為0.2mg/kg和0.5mg/kg。建立雞組織中4,4＇-二硝基均二苯脲的檢測方法對于加強畜牧業(yè)的衛(wèi)生安全管理，以及進(jìn)出口禽產(chǎn)品質(zhì)量把關(guān)重大意義。

目前有關(guān)尼卡巴嗪殘留標(biāo)識物4,4＇-二硝基均二苯脲的檢測方法在國外文獻(xiàn)中已有報道[1-6]。國內(nèi)文獻(xiàn)及國外早期文獻(xiàn)和國內(nèi)發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)方法主要研究了尼卡巴嗪原藥的方法[7-12]。研究尼卡巴嗪殘留標(biāo)識物的文獻(xiàn)僅有水產(chǎn)品中尼卡巴嗪殘留標(biāo)識物4,4＇-二硝基均二苯脲的檢測方法[13]以及雞蛋和雞肉中尼卡巴嗪殘留標(biāo)識物4,4＇-二硝基均二苯脲的液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[14]。未見有液相色譜法對尼卡巴嗪用藥的主要使用對象雞及其殘留標(biāo)識物檢測的報道。本實驗擬結(jié)合國外研究的成果，利用液液萃取凈化的樣品前處理技術(shù)，應(yīng)用液相色譜分析雞組織中的DNC，為雞組織，包括雞肉、雞肝和蛋中的DNC的檢測提供可行性方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4,4＇-二硝基均二苯脲標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.5%) 德國Witega公司；乙腈(色譜純) 德國Meker公司；正己烷、乙酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、氫氧化鉀、無水硫酸鈉(均為分析純) 廣州分析試劑廠；超純水(由Mill-Q純水系統(tǒng)制得)。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜系統(tǒng)(配有Waters515泵、717自動進(jìn)樣器、2487雙通道紫外檢測器、Empower 色譜工作站)美國Waters公司；勻漿機、渦旋振蕩器 德國IKA公司；離心機 德國Sigma公司；減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

準(zhǔn)確稱取適量雙硝基均二苯脲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加N,N-二甲基甲酰胺5mL溶解，用乙腈配成質(zhì)量濃度為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。臨用前用乙腈稀釋成合適的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：Discovery C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-體積分?jǐn)?shù)1%乙酸溶液(53:47，V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μL；檢測波長：350nm。

1.5 樣品前處理

稱取5g試樣于50mL離心管中，加入10mL乙腈、0.2mL 0.5g/mL氫氧化鉀溶液和3g無水硫酸鈉，均質(zhì)30s，3500r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到25mL容量瓶中，殘渣加入10mL乙腈和0.2mL 質(zhì)量濃度0.5g/mL的氫氧化鉀溶液，渦旋振蕩提取2min，3500r/min離心5min，合并上清液，用乙腈定容至刻度，待凈化。

移取2.0mL上述提取液于25mL濃縮瓶中，加入3mL乙腈飽和正己烷，渦旋振蕩，靜置分層，棄去上層。再加入3mL乙腈飽和正己烷，重復(fù)操作。下層提取液于40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用乙腈溶解殘渣，定容至2.0mL，過0.20μm濾膜，供液相色譜測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶液的選擇

動物組織中4,4＇-二硝基均二苯脲殘留的檢測，國內(nèi)外文獻(xiàn)報道的提取溶劑有乙腈和DMF。本實驗比較了多種不同提取溶劑的提取效率，雞肉樣品添加1mg/ kg，以0.1g/mL DMF乙腈溶液和堿性乙腈溶液提取，回收率均大于80%。結(jié)果表明DMF乙腈混合溶液和堿性乙腈溶液效果都較理想。最終采用堿性乙腈，即10mL乙腈-200μL 0.5g/mL氫氧化鉀溶液作為提取溶液。

2.2 凈化條件的選擇

樣品用乙腈提取，可能提取出大量雜質(zhì)，因此提取后需除去雜質(zhì)而凈化。采用正己烷對提取液進(jìn)行液液分配脫脂。由于尼卡巴嗪的最大吸收波長是350nm，在此吸收波長處干擾物質(zhì)少，單純的液液萃取脫脂后樣液已滿足凈化效果，而且回收率理想、重現(xiàn)性好。乙腈和正己烷有些互溶性，導(dǎo)致下層乙腈層體積不準(zhǔn)確，故脫脂后采用旋干下層再重新定容，以保證定量的準(zhǔn)確性。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

采用乙腈-體積分?jǐn)?shù)1.0%乙酸溶液。選用Discovery C18色譜柱，流速為1.0mL/min，4,4＇-二硝基均二苯脲在比例為53:47(V/V)的情況下達(dá)到很好的分離，分析物保留時間附近無干擾峰(圖1)。

圖1 4,4＇-二硝基均二苯脲標(biāo)準(zhǔn)品(0.01mg/L)液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of DNC standard at 0.1 mg/L level

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 方法的線性范圍和定量限

液相色譜測定4,4＇-二硝基均二苯脲，用乙腈配成0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，質(zhì)量濃度由低到高進(jìn)樣檢測，以峰面積-質(zhì)量濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=1.46×105X－2.99×

102，相關(guān)系數(shù)為0.995。實驗測得測定雞組織(雞肉、雞臟及雞蛋)中4,4＇-二硝基均二苯脲殘留量的定量限均為0.050mg/kg。

2.4.2 方法的回收率與精密度

分別用不含4,4＇-二硝基均二苯脲的雞肉、雞肝、雞蛋進(jìn)行添加回收率和精密度實驗，結(jié)果見表1。

表1 樣品中添加4,4＇-二硝基均二苯脲的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=10)Table 1 Average recoveries of 10 replicates for DNC in chicken meat, liver and eggs spiked at different levels (n=10)

圖2 雞組織空白和加標(biāo)樣品的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of blank and spiked chicken tissue samples

各樣品空白和添加定量限水平的液相色譜圖見圖2。由圖可見，在藥物的出峰時間，樣品無干擾峰。該法的提取條件和色譜條件有效可行。

3 結(jié) 論

結(jié)果表明，在添加0.05～0.50mg/kg標(biāo)準(zhǔn)品的范圍內(nèi)，回收率在80%～110%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。本方法的回收率和精密度符合SN/T 0001—1995《出口商品中農(nóng)藥、獸藥殘留量及生物毒素檢驗方法標(biāo)準(zhǔn)編寫的基本規(guī)定》[15]對回收率和精密度的要求。本方法準(zhǔn)確、實用、適合雞組織中尼卡巴嗪的檢測。

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HPLC Determination of Nicarbazin Residue in Chicken Tissues

XIE Shou-xin1，LIN Hai-dan2，YAO Yang-xun2，SHAO Lin-zhi2，WU Ying-xuan2
(1. Guangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510623, China；2. Food Testing Laboratory, Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangzhou 510623, China)

A high performance liquid chromatographic (HPLC) assay with UV detection of 4,4＇- dinitrocarbanilide (DNC), the marker residue for nicarbazin, was developed for the determination of nicarbazin residue in chicken tissues. Samples were extracted with a 50% aqueous potassium hydroxide solution containing acetonitrile, and the resulting extract was then treated with n-hexane for the removal of lipids prior to HPLC analysis using a mobile phase composed of a mixture of acetonitrile and an 1% aqueous acetic acid solution at a flow rate of 1.0 mL/min with UV detection at the 350-nm wavelength. Average recoveries of 10 replicates for DNC in chicken meat, liver and eggs spiked at 3 levels (0.05, 0.20 mg/kg and 0.50 mg/kg) were within the range of 93.6%－102.0%, with a RSD ranging from 2.8% to 10.4%. The method detection limit was 0.05 mg/kg. This method, thanks its simplicity and high accuracy, is most suitable for the determination of nicrabazin residue 4,4＇- dinitrocarbanilide in chicken tissues.

chicken tissues；nicarbazin residue；4,4＇- dinitrocarbanilide；high performance liquid chromatography (HPLC)

O657.72

A

1002-6630(2010)10-0275-04

2009-08-31

謝守新(1972—)，男，高級工程師，碩士，主要從事食品中獸藥殘留和食品添加劑殘留檢測研究。E-mail：linhaidangz@yahoo.com.cn