高效液相色譜法測定雞組織中尼卡巴嗪標識殘留物

謝守新，林海丹，姚仰勛，邵琳智，吳映璇

(1.廣州出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623；2.廣東檢驗檢疫技術中心食品實驗室，廣東 廣州 510623)

高效液相色譜法測定雞組織中尼卡巴嗪標識殘留物

謝守新1，林海丹2，姚仰勛2，邵琳智2，吳映璇2

(1.廣州出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623；2.廣東檢驗檢疫技術中心食品實驗室，廣東 廣州 510623)

應用高效液相色譜法測定雞組織中尼卡巴嗪標識殘留物——4,4＇-二硝基均二苯脲。試樣經乙腈-0.5g/mL氫氧化鉀溶液提取，正己烷脫脂凈化，用高效液相色譜儀(C18柱)分析，流動相為乙腈-體積分數1%乙酸溶液(53:47，V/V)，流速1.0mL/min，紫外檢測波長為350nm。對雞肉、雞肝和雞蛋樣品進行0.05～0.50mg/kg的藥物添加回收實驗，4,4＇-二硝基均二苯脲的平均回收率為93.6%～102.0%(n=10)，相對標準偏差為2.8%～10.4%，方法的定量限為0.05mg/kg。該法簡便、準確，適用于雞組織中尼卡巴嗪標識殘留物4,4＇-二硝基均二苯脲的檢測。

雞組織；尼卡巴嗪標識殘留物；4,4＇-二硝基均二苯脲；高效液相色譜法

尼卡巴嗪(nicarbazin)為4,4＇-二硝基均二苯脲(DNC)與2-羥基-4,6-二甲基嘧啶(HDP)組成的復合物，是目前養禽業中最常使用的抗球蟲藥之一，對球蟲又有抑制合殺滅作用。其廣譜、低毒、安全，但在高用藥水平下，也會發生細胞變異，肝臟腫脹，極少數雞發生脾臟壞死和軟骨病癥。由于羥基二甲基嘧啶在動物給藥后，其吸收及其代謝比4,4＇-二硝基均二苯脲快得多，4,4＇-二硝基均二苯脲成為研究尼卡巴嗪可能殘留的關注標識物。我國及聯合國糧農組織、新西蘭、日本均以4,4＇-二硝基均二苯脲單體作為尼卡巴嗪的殘留標識物。

我國規定雞組織中尼卡巴嗪標識殘留物最大殘留限量為0.2mg/kg，國際食品法典委員會規定雞組織中為0.2mg/kg，加拿大規定雞可食用組織為4.0mg/kg，日本肯定列表中規定雞肉為0.2mg/kg。聯合國糧農組織和新西蘭規定禽肉中最大殘留限量分別為0.2mg/kg和0.5mg/kg。建立雞組織中4,4＇-二硝基均二苯脲的檢測方法對于加強畜牧業的衛生安全管理，以及進出口禽產品質量把關重大意義。

目前有關尼卡巴嗪殘留標識物4,4＇-二硝基均二苯脲的檢測方法在國外文獻中已有報道[1-6]。國內文獻及國外早期文獻和國內發布的標準方法主要研究了尼卡巴嗪原藥的方法[7-12]。研究尼卡巴嗪殘留標識物的文獻僅有水產品中尼卡巴嗪殘留標識物4,4＇-二硝基均二苯脲的檢測方法[13]以及雞蛋和雞肉中尼卡巴嗪殘留標識物4,4＇-二硝基均二苯脲的液相色譜-質譜法(LC-MS)[14]。未見有液相色譜法對尼卡巴嗪用藥的主要使用對象雞及其殘留標識物檢測的報道。本實驗擬結合國外研究的成果，利用液液萃取凈化的樣品前處理技術，應用液相色譜分析雞組織中的DNC，為雞組織，包括雞肉、雞肝和蛋中的DNC的檢測提供可行性方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4,4＇-二硝基均二苯脲標準品(純度98.5%) 德國Witega公司；乙腈(色譜純) 德國Meker公司；正己烷、乙酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、氫氧化鉀、無水硫酸鈉(均為分析純) 廣州分析試劑廠；超純水(由Mill-Q純水系統制得)。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜系統(配有Waters515泵、717自動進樣器、2487雙通道紫外檢測器、Empower 色譜工作站)美國Waters公司；勻漿機、渦旋振蕩器 德國IKA公司；離心機 德國Sigma公司；減壓旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司。

1.3 標準工作液的配制

準確稱取適量雙硝基均二苯脲標準物質，加N,N-二甲基甲酰胺5mL溶解，用乙腈配成質量濃度為100mg/L的標準貯備溶液。臨用前用乙腈稀釋成合適的標準工作溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：Discovery C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-體積分數1%乙酸溶液(53:47，V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；進樣量：20μL；檢測波長：350nm。

1.5 樣品前處理

稱取5g試樣于50mL離心管中，加入10mL乙腈、0.2mL 0.5g/mL氫氧化鉀溶液和3g無水硫酸鈉，均質30s，3500r/min離心5min，上清液轉移到25mL容量瓶中，殘渣加入10mL乙腈和0.2mL 質量濃度0.5g/mL的氫氧化鉀溶液，渦旋振蕩提取2min，3500r/min離心5min，合并上清液，用乙腈定容至刻度，待凈化。

移取2.0mL上述提取液于25mL濃縮瓶中，加入3mL乙腈飽和正己烷，渦旋振蕩，靜置分層，棄去上層。再加入3mL乙腈飽和正己烷，重復操作。下層提取液于40℃條件下旋轉蒸發至近干，用乙腈溶解殘渣，定容至2.0mL，過0.20μm濾膜，供液相色譜測定。

2 結果與分析

2.1 提取溶液的選擇

動物組織中4,4＇-二硝基均二苯脲殘留的檢測，國內外文獻報道的提取溶劑有乙腈和DMF。本實驗比較了多種不同提取溶劑的提取效率，雞肉樣品添加1mg/ kg，以0.1g/mL DMF乙腈溶液和堿性乙腈溶液提取，回收率均大于80%。結果表明DMF乙腈混合溶液和堿性乙腈溶液效果都較理想。最終采用堿性乙腈，即10mL乙腈-200μL 0.5g/mL氫氧化鉀溶液作為提取溶液。

2.2 凈化條件的選擇

樣品用乙腈提取，可能提取出大量雜質，因此提取后需除去雜質而凈化。采用正己烷對提取液進行液液分配脫脂。由于尼卡巴嗪的最大吸收波長是350nm，在此吸收波長處干擾物質少，單純的液液萃取脫脂后樣液已滿足凈化效果，而且回收率理想、重現性好。乙腈和正己烷有些互溶性，導致下層乙腈層體積不準確，故脫脂后采用旋干下層再重新定容，以保證定量的準確性。

2.3 色譜條件的優化

采用乙腈-體積分數1.0%乙酸溶液。選用Discovery C18色譜柱，流速為1.0mL/min，4,4＇-二硝基均二苯脲在比例為53:47(V/V)的情況下達到很好的分離，分析物保留時間附近無干擾峰(圖1)。

圖1 4,4＇-二硝基均二苯脲標準品(0.01mg/L)液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of DNC standard at 0.1 mg/L level

2.4 方法學驗證

2.4.1 方法的線性范圍和定量限

液相色譜測定4,4＇-二硝基均二苯脲，用乙腈配成0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mg/L的標準工作液，質量濃度由低到高進樣檢測，以峰面積-質量濃度作圖，得到標準曲線回歸方程為Y=1.46×105X－2.99×

102，相關系數為0.995。實驗測得測定雞組織(雞肉、雞臟及雞蛋)中4,4＇-二硝基均二苯脲殘留量的定量限均為0.050mg/kg。

2.4.2 方法的回收率與精密度

分別用不含4,4＇-二硝基均二苯脲的雞肉、雞肝、雞蛋進行添加回收率和精密度實驗，結果見表1。

表1 樣品中添加4,4＇-二硝基均二苯脲的回收率和相對標準偏差(n=10)Table 1 Average recoveries of 10 replicates for DNC in chicken meat, liver and eggs spiked at different levels (n=10)

圖2 雞組織空白和加標樣品的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of blank and spiked chicken tissue samples

各樣品空白和添加定量限水平的液相色譜圖見圖2。由圖可見，在藥物的出峰時間，樣品無干擾峰。該法的提取條件和色譜條件有效可行。

3 結 論

結果表明，在添加0.05～0.50mg/kg標準品的范圍內，回收率在80%～110%之間，相對標準偏差小于10%。本方法的回收率和精密度符合SN/T 0001—1995《出口商品中農藥、獸藥殘留量及生物毒素檢驗方法標準編寫的基本規定》[15]對回收率和精密度的要求。本方法準確、實用、適合雞組織中尼卡巴嗪的檢測。

[1]STAHL R S, JOHNSTON J J. High-performance liquid chromatography-based determination of nicarbazin excretion in waterfowl[J]. Journal of Chromatography B, 2002, 775: 103-108.

[2]CAPURRO E, DANAHER M, ANASTASIO A, et al. Effcient HPLC

method for the determination of nicarbazin as dinitrocarbanilide in broiler liver[J]. Journal of Chromatography B, 2005, 822: 154-159.

[3]MORTIER L, DAESLEIRE E, DELAHAUT P. Simultaneous detection of five coccidiostats in eggs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2003, 483: 27-37.

[4]MORTIER L, DAESLEIRE E, van PETEGHEM C. Liquid chromatographic tandem mass spectrometric determination of five coccidiostats in poultry eggs and feed[J]. Journal of Chromatography B, 2005, 820: 261-270.

[5]DUBOIS M, PIERRET G, DELAHAUT P. Efficient and sensitive detection of residues of nien coccidiostats in egg and muscle by liquid chromatography-eletrosprqy tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2004, 813: 181-189.

[6]STAHL R S, VERCANTERER K, TERESA L. Determination of 4,4＇-dinitrocarbanilide (DNC) a component of nicarbazin in canada goose (Branta canadensis) eggshells using high-performance liquid chromatogryphy[J]. Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51: 1130-1135.

[7]DHARMENDR K, MATABUDUL, CROSBY N T. A new rapid method for the dtermination of nicarbazin residues in poultry feed, eggs and muscle tissue using supercritical fluid extraction and high performance liquid chromatography[J]. The Analyst, 1999, 124: 499-502.

[8]章虎, 吳俐勤, 楊彩梅, 等. 尼卡巴嗪殘留量測定和安全性分析[J].現代科學儀器, 2005(1): 68-70.

[9]陳家華. 雞肉中尼卡巴嗪殘留的快速測定方法[J]. 現代商檢科技, 1993, 3(6): 45-46.

[10]邵慶均, 張金枝, 宣士榮, 等. 反相液相色譜法測定飼料中尼卡巴嗪含量[J]. 分析化學, 2003, 31(11): 1376-1378.

[11]GB/T 19423—2003 飼料中尼卡巴嗪的測定: 高效液相色譜法[S].

[12]SN 0216—1993 出口禽肉中尼卡巴嗪殘留量檢驗方法[S].

[13]于慧娟, 姜朝軍, 惠蕓華, 等. 高效液相色譜法測定水產品中4,4＇-二硝基均二苯脲[J]. 分析試驗室, 2008, 27(12): 119-121.

[14]孫雷, 張驪, 劉智宏, 等. 雞蛋和雞肉中尼卡巴嗪殘留量檢測: 高效液相色譜-串聯質譜法研究[J]. 中國獸藥雜志, 2008, 42(5): 1-4.

[15]SN/T 0001—1995 出口商品中農藥、獸藥殘留量及生物毒素檢驗方法標準編寫的基本規定[S].

HPLC Determination of Nicarbazin Residue in Chicken Tissues

XIE Shou-xin1，LIN Hai-dan2，YAO Yang-xun2，SHAO Lin-zhi2，WU Ying-xuan2
(1. Guangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510623, China；2. Food Testing Laboratory, Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangzhou 510623, China)

A high performance liquid chromatographic (HPLC) assay with UV detection of 4,4＇- dinitrocarbanilide (DNC), the marker residue for nicarbazin, was developed for the determination of nicarbazin residue in chicken tissues. Samples were extracted with a 50% aqueous potassium hydroxide solution containing acetonitrile, and the resulting extract was then treated with n-hexane for the removal of lipids prior to HPLC analysis using a mobile phase composed of a mixture of acetonitrile and an 1% aqueous acetic acid solution at a flow rate of 1.0 mL/min with UV detection at the 350-nm wavelength. Average recoveries of 10 replicates for DNC in chicken meat, liver and eggs spiked at 3 levels (0.05, 0.20 mg/kg and 0.50 mg/kg) were within the range of 93.6%－102.0%, with a RSD ranging from 2.8% to 10.4%. The method detection limit was 0.05 mg/kg. This method, thanks its simplicity and high accuracy, is most suitable for the determination of nicrabazin residue 4,4＇- dinitrocarbanilide in chicken tissues.

chicken tissues；nicarbazin residue；4,4＇- dinitrocarbanilide；high performance liquid chromatography (HPLC)

O657.72

A

1002-6630(2010)10-0275-04

2009-08-31

謝守新(1972—)，男，高級工程師，碩士，主要從事食品中獸藥殘留和食品添加劑殘留檢測研究。E-mail：linhaidangz@yahoo.com.cn