胞內感染病原體與細胞自噬相互作用的研究進展

王琦,蘇舒,王立新

(東南大學醫學院病原生物學與免疫學系,江蘇南京 210009)

自噬性細胞死亡的現象早在20世紀60年代就已被發現,它是指細胞內的溶酶體降解自身細胞器和其他大分子的過程。當細胞在缺乏營養或發生應激反應時,可發生細胞自噬現象(autophagy)。細胞開始自噬時,細胞質中形成大量由雙層膜包裹著的待降解物質的泡狀結構,稱自噬小體(autophagosome),隨后,自噬小體與溶酶體發生融合形成自噬溶酶體,自噬泡所包裹著的待降解物質在溶酶體所含酶的作用下分解成氨基酸和核苷酸等,并進入三羧酸循環,產生小分子和能量(ATP),再被細胞所利用。因此,長期以來細胞自噬被認為是細胞的自救行為,溶酶體參與其中的全過程。自噬在生理過程的作用大體可以分為3種:參與細胞的發育和分化過程;營養缺乏時產生氨基酸;清除不需要的和損傷的細胞器與分子[1]。

近來研究發現,細胞自噬在胞內感染性病原體的防御機制方面也發揮重要作用。一方面,胞內感染性細菌和病毒在逃脫非吞噬細胞的內吞體后,可被自噬體內化、降解,從而促進細胞對胞內感染的病原體的清除[2];另一方面,胞內感染病原體通過某些機制逃避宿主細胞的自噬,與胞內感染性病原體的致病機制有關[3-8]。

1 胞內感染性細菌與細胞自噬

最近研究表明,細胞自噬是對抗胞內細菌感染最有效的武器,通常情況下,胞內細菌被宿主細胞內吞后進入胞漿,宿主細胞會啟動自噬途徑,自噬小體將其包裹,并運送到溶酶體中降解。

目前認為,胞內感染性細菌的致病機制可能與病原體入侵細胞后干擾細胞的自噬過程有關:干擾自噬體與溶酶體的融合避免被降解;通過分泌某種蛋白延緩自噬體向自噬溶酶體的轉變從而停留在自噬體樣結構的囊泡中復制;在免疫系統的巨噬細胞中分泌的蛋白促進自噬體樣結構的形成;或者干擾自噬體的成熟,促進自身的存活。

結核分枝桿菌是一種胞內感染病原體,其致病機制可能與干擾自噬體與溶酶體的融合、抑制自噬途徑使得自噬體中的結核分枝桿菌不被降解等有關。Gutierrez等[3]發現,采用饑餓或雷帕霉素(rapamycin)上調宿主細胞的自噬時,結核桿菌會被轉運到感染細胞的溶酶體中降解,雷帕霉素的藥理刺激使得吞噬小體的生成聚集從而促進自噬。同時發現,自噬相關基因產物Beclin-1刺激吞噬小體的聚集,Beclin-1是hVPS34-PI3K(人類空泡蛋白34-磷脂酰肌醇3激酶)復合體上的促進自噬的亞基,含有結核分枝桿菌的吞噬體與Beclin-1相連接,促進含菌空泡體的發生自噬,從而使得結核桿菌減少。LC3(微管相關蛋白輕鏈-3)是唯一被發現的自噬體特征性標記,定位在自噬體的雙層膜上。Gutierrez等[3]還發現,加入IFN-γ不僅使巨噬細胞的LC3含量發生變化,而且結核桿菌與LC3發生共同定位現象,自噬的誘導使得胞內生存的成熟結核桿菌減少,該共同定位現象能被自噬阻斷劑(3MA,wortmannin)所拮抗,提示IFN-γ抗結核菌的效應可能與誘導巨噬細胞產生自噬有關。Jagannath等[4]也發現,用野生型結核分支桿菌減毒菌株或卡介苗(BCG)干預的小鼠,在雷帕霉素誘導的自噬作用下,抗原呈遞細胞表達抗原Ag85B明顯增強,雷帕霉素還使得結核分支桿菌局限在感染細胞的自噬小體和溶酶體中。

Ogawa等[5]報道,志賀桿菌(Shigella Flexneri)通過Ⅲ型分泌系統(the typeⅢsecretion system,TTSS)所分泌的蛋白IcsB(志賀桿菌質粒編碼的蛋白,定位在細菌表面)逃避宿主細胞的自噬;作者采用MDCK細胞(狗腎上皮細胞)作為志賀桿菌的感染模型,研究發現,感染6 h后,野生型志賀桿菌的IcsB與自噬小體標記LC3共同定位率只有10%～15%,而突變型賀桿菌的△icsB與自噬小體標記LC3共同定位率上升至50%。在缺乏氨基酸的饑餓條件下感染1 h,野生型志賀桿菌和突變型賀桿菌(△icsB)與自噬小體標記LC3共同定位率均有所增加(野生型志賀桿菌10%～16%;突變型賀桿菌23%～36%);而采用自噬抑制劑(如3-MA,Wortmannin)干預時,野生型志賀桿菌和突變型賀桿菌(△icsB)與自噬小體標記LC3共同定位率均明顯減少,該現象提示志賀桿菌表面的IcsB蛋白與野生型志賀桿菌逃避宿主細胞的自噬作用有關。VirG蛋白(志賀桿菌Vir基因編碼,參與肌動蛋白有關的細胞內運動)作為一種細菌靶分子,宿主細胞的自噬相關蛋白Atg-5能與VirG蛋白特異性結合,從而誘導細胞自噬。進一步研究顯示,IcsB并不直接抑制自噬,而是封閉或阻斷Atg-5與VirG的特異性結合,進而間接地阻斷自噬體包裹志賀桿菌,引起志賀桿菌的細胞內感染[5]。

沙門菌(Salmonella)和軍團菌都可以利用分泌系統影響自噬途徑。細菌分泌的蛋白可以促進自噬體樣結構的形成,或者干擾自噬體的成熟,促進自身的存活。沙門菌可以引起巨噬細胞的程序性細胞死亡,促進自噬體樣結構的形成,這個過程是依賴于Ⅲ型蛋白分泌系統。SipB是一種具有膜融合作用的蛋白質,它通過Ⅲ型蛋白分泌系統被送到宿主細胞中。沙門菌表達SipB時,能形成獨特的、洋蔥樣的膜結構,該膜結構包含了線粒體和內質網,從而使細胞缺乏能量供應,細胞發生程序性死亡。而這種程序性死亡既有Ⅰ型程序性死亡的特征(如染色質及DNA的破壞),又有Ⅱ型程序性死亡即自噬的特征(如不需要啟動凋亡基因的活化),而在沙門菌感染巨噬細胞時,SipB可以在腫脹的線粒體中發現。沙門菌感染的巨噬細胞可以出現自噬小泡的聚集,由此可以推測沙門菌通過SipB分裂線粒體引發自噬活動,從而造成巨噬細胞的死亡[6]。

而嗜肺軍團菌逃避溶酶體的融合、在胞內的復制以及宿主細胞的溶解是依賴dot/icm基因復合體編碼出的Ⅳ型分泌系統,空泡小體包裹嗜肺軍團菌的過程比典型的自噬體包裹過程要慢,它還通過Ⅳ型分泌系統釋放阻礙吞噬小泡成熟的因子,使溶酶體酶的作用延遲。自噬體和包裹嗜肺軍團菌的吞噬小泡在最后階段都需要溶酶體的特性,如LAMP-1(溶酶體聯合膜蛋白-1)、組織蛋白酶D、p H呈酸性等,但在成熟過程中,一部分的吞噬小體在特定自噬的標志(如Atg7,LC3等)下發生聚集。對于嗜肺軍團菌感染過程的分析表明,細胞內的分泌途徑對自噬途徑有很大影響[7]。

近來研究發現,幽門螺旋桿菌的感染會誘發巨噬細胞產生自噬小體,并且在其中進行復制,部分臺灣臨床菌株可在巨噬細胞中的雙層膜結構中進行復制,自噬小體的形成與幽門螺桿菌的復制呈相關關系。如采用雷帕霉素(自噬的誘導劑)上調細胞的自噬水平,幽門螺桿菌的復制亦上調;而采用3-MA(3-甲基腺嘌呤,自噬的特異性的抑制劑)下調細胞的自噬,幽門螺桿菌的復制則被下調[8]。

2 病毒感染與細胞自噬

病毒與細胞自噬相互作用的結果大致分為3種:一是自噬成功的阻止了病毒的復制;二是病毒病毒阻斷了自噬,或者是誘導某些不完全的自噬過程,從而避免了自噬對其復制的限制;三是病毒利用自噬小體的形成促進自身的復制[9-13]。

自噬在病毒感染中起到的積極作用主要表現在其呈遞抗原成分,并被胞內受體探測到,從而啟動自噬反應。水痘-帶狀皰疹病毒(VSV)與Toll樣受體(TLR-7)的結合誘導了漿細胞樣樹突狀細胞(pDCS)的激活以及Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)的分泌,從而啟動了自噬反應,抑制了病毒的復制。有研究[9]表明,VZV誘導的自噬最終導致細胞質蛋白的變性,自噬被聚丙乙酸敏感的病毒產物所臨時觸發,在VZV感染的體外培養細胞自噬的降解途徑發生在較晚的時間點。檢測自噬標記物LC3B、p62/SQSTM1以及電鏡觀察結果顯示,自噬小體在感染早期形成而在感染晚期進行降解,說明一些早期出現的病毒其基因產物的積累可能是自噬過程的主要刺激者[9]。

某些病毒感染能激活宿主細胞的自噬途徑,有研究[10]表明,一些RNA病毒感染時誘導形成自噬體樣結構,雙鏈RNA活化的蛋白激酶受體(PKR)激活的下游事件之一是Beclin-1依賴的自噬途徑的激活,它通過磷酸化真核細胞翻譯起始因子eIF2α啟動胞內相應的蛋白質的翻譯,從而抑制或下調病毒復制,同時誘導自噬途徑。而 γ134.5基因編碼的產物ICP34.5可以通過磷酸酶使eIF2α去磷酸化而拮抗PKR的作用,從而抑制自噬,這可以成為病毒的對宿主細胞造成破壞的機制。1型單純皰疹病毒(HSV-1)的神經毒力因子ICP34.5(由 γ134.5基因編碼)有與自噬的調節因子Beclin-1結合的結構域,可以通過與自噬的調節因子Beclin-1的互相作用阻斷自噬過程,其具體機制現尚未闡明。用野生型HSV-1的感染鼠的胚胎成纖維細胞(MEFs),并沒有發現長壽命蛋白降解數量上的明顯增加或者是自噬體總體積的明顯增大,自噬體形成指標未見明顯增加;而 γ134.5基因缺陷型HSV-1感染細胞,則發現自噬形成指標LC3明顯增加。

電鏡觀察[11]顯示,丙型肝炎病毒(HCV)感染能誘導宿主細胞自噬小體空泡樣結構的生成,HCV感染可誘導細胞內質網壓力的產生,使細胞在逆境下發生錯誤折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR),使許多未折疊或錯誤折疊的蛋白質聚集。先前研究[11]證實,細胞內質網壓力可借UPR途徑誘導細胞自噬小體的產生,HCV誘導宿主細胞自噬小體空泡樣結構的形成需要UPR的參與,如果利用siRNA抑制UPR途徑上重要分子的活性,將會抑制HCV誘導LC3的脂化,導致LC3-Ⅱ的下調,進而阻礙自噬體的形成,從而促進病毒的復制。對HCV感染細胞的長壽蛋白降解速率以及在自噬溶酶體水平的研究表明,雖然HCV誘導自噬小體空泡樣結構的生成,但不能加強自噬蛋白的降解速率,而是抑制感染細胞內自噬體與溶酶體的融合,阻礙自噬反應的持續進行。總之,這些研究表明,HCV病毒能夠阻止自噬之類的細胞反應,甚至為其復制服務,而自噬及內質網壓力對病毒的復制產生了一定推動作用[12]。

而還有一些病毒,比如人類免疫缺陷病毒(HIV)可應用自噬的分子機制為自身服務[13]。HIV在旁觀CD4+T細胞中誘導自噬依賴性的凋亡或者自噬細胞的死亡,這種情況發生在HIV-1的包裹蛋白與趨化因子受體CXCR4[趨化因子基質細胞衍生因子-1(CXCL12)的特異受體]在CD4+細胞表面的結合。包膜蛋白介導的自噬需要觸發CD4+T細胞的凋亡,從而表明HIV感染誘導的自噬促進了旁觀CD4+T的破壞。在急性感染中,HIV感染的細胞可以通過Beclin-1和LC3-Ⅱ這些自噬標志的下調檢測到自噬活動的下調。自噬在病毒誘導的細胞死亡中并不是單獨起作用,而是協助細胞凋亡作用,HIV病毒調節細胞的自噬性死亡可以看作是病毒規避免疫系統并且促進自身復制的一種方式。

3 問題與展望

目前分子生物學家和細胞生物學家對自噬及自噬性程序性細胞死亡的認識還處于初級階段,關于自噬現象的參與分子、信號轉導過程、病理生理學意義的研究還有待進一步深入。自噬給我們提供了一個研究細胞內生物化學機制的獨特途徑,而胞內感染的病原體對自噬應答的作用可以進一步幫助我們探究自噬反應的調控,同時使我們更加明確病原體對機體的損傷機制,我們也可以合理利用自噬爭取在創新藥物、改進疫苗等方面有所發展。

[1]YORIMITSU T,KLIONSKY D J.Autophagy:molecular machinery for self-eating[J].Cell Death and Differ,2005,12(2):1542-1552.

[2]LEVINE B.Eating oneself and uninvited guests:autophagyrelated pathways in cellular defense[J].Cell,2005,2(120):2159-2162.

[3]GUTIERREZ M G,MASTE R S S,SUDHA B.Autophagy is a defense,mechanism inhibiting BCG and mycobacterium tuberculosis survival in infected macrophages[J].Cell,2004,6(119):753-766.

[4]JAGANNATH C,LINDSEY D R,DHANDAYUTHAPANI S,et al.Autophagy enhances the efficacy of BCG vaccine by increasing peptide presentation in mouse dendritic cells[J].Nat Med,2009,15(3):267-276.

[5]OGAWA M,YOSHIMORI T,MIZUSHIMA N,et al.Escape of intracellular Shigella from autophagy[J].Science,2005,4307(5710):727-731.

[6]HERNANDEZ L D,PYPAERT M,FLAVELL R A,et al.Salmonella protein causes macrophage cell death by inducing autophagy[J].J Cell Biol,2009,5(163):1123-1131.

[7]CAMPOY E,COLOMBO M I.Autophagy in intracellular bacterial infection[J].Biochim Biophys Acta,2009,1793(9):1465-1477.

[8]WANG Y H,LEI H Y.The Autophagic induction in helicobacter pylori-infected macrophage[J].Exp Biol Med,2009,234(2):171-180.

[9]TAKAHASHI M N,JACKSON W,LAIRD D T,et al.Varicella-zoster virus infection induces autophagy in both[J].Virol,2009,83(11):5466-5476.

[10]TALLóCZY Z,JIANG W,VIRGIN H W,et al.Regulation of starvation and virus-induced autophagy by the el F2 alpha kinase signaling pathway[J].PNAS,2002,99(1):190-195.

[11]OGATA M,HINOS I,SAITO A,et al.Autophagy is activated for cell survival after endoplasmic reticulum stress[J].Molecular Cell Biology,2006,26(24):9220-9231.

[12]SIR D,CHEN W L,CHOI J,et al.Induction of incomplete autophagic response by hepatitis C virus via the unfolded protein response[J].Hepatology,2008,48(4):1054-1061.

[13]GOUGEON M L,PIACENTINI M.New insights on the role of apoptosis and autophage in HIV pathogenesis[J].Apoptosis,2009,4(14):501-508.