肺部馬爾尼菲青霉菌感染動物模型制作

梁 義,尹 琦,陳 勇

(廣西柳州市柳鐵中心醫(yī)院皮膚科 545007)

隨著廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和抗腫瘤化療藥物等的廣泛應(yīng)用,以及器官移植的廣泛開展,近年來侵襲性馬爾尼菲青霉菌感染(PSM)發(fā)病率和病死率逐年升高。肺臟是PSM最常見的感染部位[1],常規(guī)診斷方法存在許多局限性或敏感性、特異性低,或時效性差或標本取材困難[2],亟待建立更為可靠﹑快速的診斷方法。血漿馬爾尼菲青霉菌細胞壁成分1,3-β-D-葡聚糖檢測已成為目前倍受關(guān)注的侵襲性馬爾尼菲青霉菌感染診斷方法[3]。本研究通過制作肺部馬爾尼菲青霉菌感染動物模型,為以后檢測血漿中1,3-β-D-葡聚糖水平并評價其在肺部馬爾尼菲青霉菌感染中的診斷價值,為臨床上推廣應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 實驗用馬爾尼菲青霉菌由本院微生物室提供。

1.2 實驗動物 清潔級健康成年SD新西蘭大白兔,重約1 000～1 500g,雌雄不限,共75只,由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 將75只新西蘭大白兔隨機分成3個組,每組25只,分別為肺部馬爾尼菲青霉菌感染免疫抑制組(A組)、免疫抑制健康組(B組)、肺部馬爾尼菲青霉菌感染健康組(C組)。

1.3.2 肺部感染動物模型制作 (1)真菌感染動物模型:用生理鹽水將在37℃培養(yǎng)、生長旺盛的馬爾尼菲青霉菌配制成1×109cfu/mL混懸液,將新西蘭大白兔給予氯胺酮(100mg/kg,腹腔注射)麻醉、固定后,用自制氣管插管分別插入A組和C組新西蘭大白兔氣管內(nèi),將馬爾尼菲青霉菌混懸液分別注入A組和C組的新西蘭大白兔氣管內(nèi),按106cfu/g每次注入混懸液0.5～1.0mL,1次/天,連續(xù)3d。接種前3d開始肌內(nèi)注射環(huán)孢霉素A,給予A組和B組的每只新西蘭大白兔環(huán)孢霉素A 5.0mg/(kg?d),直至接種結(jié)束。(2)B組新西蘭大白兔只給予同量的環(huán)孢霉素A肌肉注射后,不作任何其他處理。接種完成后每天觀察各組新西蘭大白兔的精神狀態(tài)、活動、飲食及一般狀況。接種后頭3d各組新西蘭大白兔未出現(xiàn)明顯異常。第7、8天時,4只A組的新西蘭大白兔出現(xiàn)精神萎靡、活動進食減少現(xiàn)象。第9天A組的新西蘭大白兔全部發(fā)病。而B組和C組的新西蘭大白兔均未出現(xiàn)明顯異常表現(xiàn)。于接種后第9天以無菌操作采取各組新西蘭大白兔血標本和肺組織標本,采血方法均經(jīng)心臟穿刺取血4～5mL,經(jīng)心臟穿刺新西蘭大白兔死亡后統(tǒng)一取新西蘭大白兔右肺組織。各組血標本均以無菌抗凝管收集,分別留取A組、B組和C組的每只新西蘭大白兔的血標本2～3 mL送本院微生物室以葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基做真菌培養(yǎng)。

2 結(jié) 果

各組模型動物肺組織病理結(jié)果:(1)A組,25只新西蘭大白兔中,有25只的肺組織中發(fā)現(xiàn)馬爾尼菲青霉菌菌絲、孢子。肺組織均見程度不等的中性粒細胞和巨噬細胞等炎性細胞浸潤及壞死灶形成;并有組織細胞肉芽腫形成,肉芽腫可擴大融合,中央壞死和白細胞反應(yīng)形成膿腫,膿腫壁由組織細胞構(gòu)成,膨脹的組織細胞內(nèi)有大量酵母繁殖。酵母圓形、橢圓形、臘腸形、馬蹄形。HE染色酵母胞膜、胞漿不著色,致使淡藍色的核周圍有一空暈。PAS染色陽性。Grocotts染色陽性,菌體內(nèi)橫隔著色深于胞膜,故長形、馬蹄形菌體可見橫隔,于橫隔處裂殖[4-5]。(2)B組和C組新西蘭大白兔的肺組織HE染色光鏡下呈現(xiàn)正常肺組織結(jié)構(gòu),未見有明顯炎癥病理改變。所有新西蘭大白兔血真菌培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。

3 討 論

馬爾尼菲青霉菌為肺部真菌感染的致病菌,且為條件致病菌,即宿主一般要有免疫缺陷等宿主因素才能致病。本研究中肺部感染免疫抑制模型的制作,是通過給予新西蘭大白兔環(huán)孢霉素A造成宿主的免疫抑制,并通過氣管插管方法將馬爾尼菲青霉菌注入新西蘭大白兔氣管內(nèi),使其更容易被侵襲到肺部而導(dǎo)致肺組織的真菌感染,接種馬爾尼菲青霉菌后的免疫抑制新西蘭大白兔于第9天全部出現(xiàn)精神萎靡、進食減少等癥狀,肺組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)馬爾尼菲青霉菌菌絲和孢子的侵入,并伴有相應(yīng)的炎癥病理改變,由此可確定肺部馬爾尼菲青霉菌感染模型制作成功。對于灌注菌量的選擇,本研究在參考了劉棟華等[1]、吳易等[2]、梁伶等[6]的研究數(shù)據(jù)(灌注菌量為 105cfu/g)后,根據(jù)本研究的目的和實驗動物特點,選擇的灌注菌量為106cfu/g,成功地制作了肺部馬爾尼菲青霉菌感染模型。證明在免疫抑制條件下,本研究選擇的灌注菌量106cfu/g,能100%(25/25)導(dǎo)致新西蘭大白兔肺部感染馬爾尼菲青霉菌。該結(jié)果從側(cè)面印證了臨床上馬爾尼菲青霉菌病主要發(fā)生于免疫抑制患者的肺部[1-2]。

關(guān)于馬爾尼菲青霉菌病動物模型的制作傳統(tǒng)方法有靜脈接種和腹腔內(nèi)接種等,而本研究中采用的氣管內(nèi)接種法較少見,氣管內(nèi)接種途徑對肺部感染的制作更有意義。氣管內(nèi)馬爾尼菲青霉菌接種法可以成功模仿肺部馬爾尼菲青霉菌感染模型,展現(xiàn)了實驗性馬爾尼菲青霉菌病的自然演變過程,為馬爾尼菲青霉菌病基礎(chǔ)研究的進展奠定了基礎(chǔ),同時對更加深入地研究馬爾尼菲青霉菌病的預(yù)防、診斷和治療具有一定的應(yīng)用價值。

[1]劉棟華,譚升順,梁伶,等.經(jīng)皮膚損傷感染馬爾尼菲青霉菌致病力動物實驗研究[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2006,20(6):324.

[2]吳易,梁伶,李菊裳.廣西銀星竹鼠與人馬爾尼菲青霉病關(guān)系的研究[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2004,18(4):196.

[3]Yoshida M,Roth RI,Grunfeld C,et al.Soluble 1,3-β-D-glucan purified fromCandida albicans:biologic effects and distribution in blood and organs in rabbits[J].Lab Clin Med,2000,128(1):103.

[4]黃長武,李興祿,黃藝,等.馬爾尼菲青霉菌的鑒定[J].微生物學(xué)雜志,2006,26(1):61.

[5]陳姝,婁世鋒,黃長武,等.馬爾尼菲青霉菌病1例報告并文獻復(fù)習(xí)[J].重慶醫(yī)學(xué),2005,34(4):637.

[6]梁伶,成先桂,劉棟華,等.馬爾尼菲青霉菌野生株和臨床分離株致病力研究[J].中國人獸共患病學(xué)報,2008,24(3):240.