食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定*

林智

（遼寧職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)部，遼寧鐵嶺112000）

食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定*

林智

（遼寧職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)部，遼寧鐵嶺112000）

我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.5-2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的兩種方法“凱氏定氮法”和杜馬斯（Dumas）燃燒法是先將樣品硝化后測(cè)出含氮量，然后根據(jù)氮元素與蛋白質(zhì)換算系數(shù)計(jì)算蛋白質(zhì)的含量，如果添加含氮量高的物質(zhì)，如三聚氰胺，就可以測(cè)出較高的“蛋白質(zhì)含量”。介紹4種直接測(cè)定蛋白質(zhì)的方法：考馬斯亮蘭法、雙縮脲法、Folin－酚試劑法和紫外吸收光譜法，可以避免上述由于添加違規(guī)化學(xué)物質(zhì)造成測(cè)定蛋白質(zhì)含量虛高的結(jié)果。

蛋白質(zhì)含量；考馬斯亮蘭法；雙縮脲法；Folin－酚試劑法；紫外吸收光譜法

2008 年毒奶粉事件再次敲響了食品安全的警鐘，不法分子為了提高摻水牛奶中蛋白質(zhì)的含量，添加工業(yè)原料三聚氰胺，由于我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.5-2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的2種方法“凱氏定氮法”和杜馬斯（Dumas）燃燒法只能測(cè)出含氮量，然后根據(jù)氮元素與蛋白質(zhì)換算系數(shù)計(jì)算蛋白質(zhì)的含量，但并不能區(qū)分牛奶硝化后氮的來(lái)源，如果添加違規(guī)化學(xué)物質(zhì)，就可以測(cè)出較高的“蛋白質(zhì)含量”。三聚氰胺并非惟一的替代添加物，只要含氮量大于牛奶中蛋白質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)，且性狀和價(jià)格具備條件，在理論上都存在被不法分子利用的可能性。“定氮”方法的先天不足要求采用其它的檢測(cè)方法來(lái)應(yīng)對(duì)，下面介紹幾種直接測(cè)定蛋白質(zhì)的方法。

1 直接測(cè)定蛋白質(zhì)方法

1.1 考馬斯亮蘭法

1976 年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。在酸性溶液中，考馬斯亮蘭G-250染料與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合變?yōu)樘m色，在595 nm下測(cè)定的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度成正比。此法靈敏度較高1～5μg，時(shí)間15 min左右，干擾物質(zhì)：強(qiáng)堿性緩沖溶液；SDS；TritonX-100。標(biāo)準(zhǔn)曲線有輕微的非線性，各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用品

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用g-球蛋白或牛血清蛋白（BSA），配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100 mg考馬斯亮蘭G—250，溶于50 mL 95%的乙醇后，再加入120 mL 85%的磷酸，用水稀釋至1 L。

可見(jiàn)光分光光度計(jì)；旋渦混合器；比色管；吸量管。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取7支比色管，分別加入0.00，0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mL的1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，然后用無(wú)離子水補(bǔ)充到0.1 mL。最后各試管中分別加入5.0 mL考馬斯亮蘭G—250試劑，每加完1管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。加完試劑2～5 min后，即可開(kāi)始用比色皿，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595 nm處的光吸收值。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，用吸光度值為縱坐標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）未知樣品的測(cè)定：處理樣品，稀釋使其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在1～10 mg/mL范圍內(nèi),取3支比色管分別加0.02，0.04，0.06 mL未知樣，用無(wú)離子水補(bǔ)充到0.1 mL，分別加入5.0 mL考馬斯亮蘭G—250試劑，在旋渦混合器上混合，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595 nm處的光吸收值，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線，既可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.2 雙縮脲法[1-3]

雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4結(jié)合形成紅紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵，與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，蛋白質(zhì)的種類雖不同，但發(fā)色率差別不大，組氨酸以外其它游離的氨基酸、二肽等不顯色，除雙縮脲、一亞氨基雙縮脲、二亞氨基雙縮脲、氨醇、氨基酸酰胺、丙二酰胺等少數(shù)化合物以外，非蛋白質(zhì)均不顯色，可以看做這是蛋白質(zhì)的特有反應(yīng)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。此法靈敏度較低1～20 mg，時(shí)間30 min左右，干擾物質(zhì)：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等，常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。

1.2.1 試劑與器材

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清蛋白（BSA）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用BSA質(zhì)量濃度1 mg/mL的A280為0.66來(lái)校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清蛋白用H2O或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl配制，酪蛋白用0.05 mol NaOH配制。

雙縮脲試劑：稱以1.50 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0 g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O），用500 mL水溶解，在攪拌下加入300 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH溶液，用水稀釋到1 L，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長(zhǎng)期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。

紫外光分光光度計(jì)；比色管；旋渦混合器等。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取12支比色管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1 mL，然后加入4 mL雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20～25℃）下放置30 min，于540 nm處進(jìn)行比色測(cè)定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照液。取2組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品的測(cè)定：處理樣品,稀釋使其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在1～10 mg/mL范圍內(nèi)，取3支比色管分別加0.02，0.04，0.06 mL未知樣，用上述同樣的方法，測(cè)定未知樣品的吸光度值。根據(jù)測(cè)出的未知樣品的吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線，既可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.3 Folin－酚試劑法[2-3]

酚試劑法就是來(lái)自酚試劑（磷鉬酸、磷鎢酸的混合液），在堿性條件下，和蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的呈色反應(yīng)與雙縮尿反應(yīng)的復(fù)合方法。磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。此法靈敏度高5μg左右，時(shí)間1 h左右，干擾物質(zhì)：尿素、硫酸納、硝酸納、三氯乙酸、乙醇、乙醚、丙酮等，測(cè)定時(shí)要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。

1.3.1 試劑與器材

試劑甲：（A）10 g Na2CO3，2 g NaOH和0.25 g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500 mL蒸餾水中。（B）0.5 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解于100 mL蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。

試劑乙：在2 L磨口回流瓶中，加入100 g鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O），25 g鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）及700 mL蒸餾水，再加50 mL85%磷酸，100 mL濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10 h，回流結(jié)束時(shí)，加入150 g硫酸鋰（Li2SO4），50 mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15 min，以便驅(qū)除過(guò)量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1 L，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1 mol左右。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精確稱取結(jié)晶牛血清蛋白或g—球蛋白，溶于蒸餾水，質(zhì)量濃度為250 mg/mL左右。牛血清蛋白溶于水若混濁，可改用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液。

可見(jiàn)光分光光度計(jì)；旋渦混合器；秒表；比色管。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取16支比色管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（質(zhì)量濃度為250 mg/mL）。用水補(bǔ)足到1.0 mL，然后每支試管加入5 mL試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10 min。再逐管加入0.5 mL試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30 min，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，于700 nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間，即第1支試管加入5 mL試劑甲后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，1 min后，第2支試管加入5 mL試劑甲，2 min后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過(guò)10 min，則第1支試管可立即加入0.5 mL試劑乙，1 min后第2支試管加入0.5 mL試劑乙，2 min后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30 min，然后開(kāi)始測(cè)定光吸收。每分鐘測(cè)一個(gè)樣品。

（2）樣品的測(cè)定：取1 mL樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20～250 μg），按上述方法進(jìn)行操作，取1 mL蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。測(cè)樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。

1.4 紫外吸收光譜法[2-3]

紫外吸收光譜法是直接測(cè)定芳香族氨基酸對(duì)紫外線吸收光譜（酪氨酸和色氨酸的最大吸收為280nm）及肽鍵對(duì)紫外線吸收光譜（肽鍵的最大吸收為190 nm）來(lái)定量蛋白質(zhì)的一種分析方法。

1.4.1 試劑與器材

97%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）醋酸溶液；紫外分光光度計(jì)。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：用移液管吸取牛乳0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL分別置于5只洗凈烘干的比色管中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%的醋酸溶液定容至25 mL。搖動(dòng)1 min，于紫外分光光度計(jì)用1 cm的比色皿于280 nm測(cè)定其吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品的測(cè)定：用移液管準(zhǔn)確吸取牛乳樣品0.3 mL，操作同上。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)束語(yǔ)

綜上，這幾種直接測(cè)定食品中蛋白質(zhì)的方法，靈敏度高低不同，可以滿足不同類型蛋白質(zhì)的檢測(cè)，可防止不法分子用添加違規(guī)化學(xué)物質(zhì)來(lái)獲得較高的蛋白質(zhì)。當(dāng)然，為了確保食品安全，食品檢測(cè)還是應(yīng)該根據(jù)實(shí)際情況采取不同的檢測(cè)方法或同時(shí)用幾種方法互相驗(yàn)證，這樣才能不給不法分子可乘機(jī)會(huì)，確保食品安全。

[1]吳梧桐.生物化學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2007.

[2]陳毓荃.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

[3]陳雅蕙.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M].2版.北京：北京大學(xué)出版社，2008.

[4]陳來(lái)同.生化工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京：科學(xué)出版社，2007.

[5]武漢大學(xué).分析化學(xué)[M].5版.北京：高等教育出版社，2006.

The Determination of the Protein Content in Food

LIN Zhi

（Liaoning Vocational College Department of Basic Courses，Liaoning Tieling 112000，China）

According to the current standard of Determination of Protein Content in Food GB/T5009.5-2003 in China，there are two methods to determine the protein content.They are Kjeldahl method of nitrogen determination and Dumas method.Both of the two ways determine the nitrogen content by nitrification firstly and then calculate the protein content according to the conversion coefficient between the nitrogen and protein.If such high nitrogen content chemical substance as Melamine is added to the food，the protein content will be higher accordingly.In this peper，four direct determination methods were introduced including Bradford method，Biuret method，Lowry method and ultraviolet absorption spectrometry.These methods are more precise to determine the protein content in food than Kjedahl method which often overstates the protein content due to adding the high nitrogen-containing substances.

Protein Content；Bradford method；Biuret method；Lowry method；Ultraviolet Absorption Spectrometry

TQ937

A

1671-0460（2010）02-0224-03

2009-12-01

林智（1970-），男，講師，畢業(yè)于青島海洋大學(xué)化學(xué)系化學(xué)專業(yè)。E-mail：lzsllljp@163.com。