表達特定免疫球蛋白可變區抗原的人B細胞系建立和其生物學特征

劉輝，朱平

表達特定免疫球蛋白可變區抗原的人B細胞系建立和其生物學特征

劉輝，朱平

【摘要】

【關鍵詞】淋巴瘤，B 細胞； 免疫球蛋白類； 疫苗

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2010, 5(6):410-414

淋巴瘤治療是目前腫瘤治療的難題之一，雖然目前用放化療取得了一定效果，但還不能徹底治愈這類腫瘤。近年發展的過繼性免疫治療有望開辟新的腫瘤治療途徑。在淋巴瘤的過繼免疫治療中，可以用永生化人 B 細胞系作為抗原刺激物，激活患者的淋巴細胞生成特異性的細胞毒 T 細胞（CTL）。以往 B 淋巴瘤研究發現，B 淋巴瘤的表面免疫球蛋白抗原和正常 B 淋巴細胞類似，同樣可以按照 Lefranc 提供的方法分類。這種分類是根據 B 細胞表面免疫球蛋白框架區的序列同源性，將 B 細胞或者淋巴瘤細胞分為 IgHV1 ～ IgHV7七個家族[1]，每一種腫瘤 B 細胞也分屬于其中的一個家族。淋巴瘤中 IgHV3 家族最大，約占淋巴瘤的 30% 左右。用同一家族的 B 細胞作為抗原，刺激培養中的淋巴細胞，可以誘導相應的 CTL 產生。此外，CTL 在識別 B 細胞表面免疫球蛋白抗原時，必須具有同樣類型的人白細胞抗原（HLA）。在 HLA 類型中，HLA-A*0201 是在中國人群中最常見的類型之一。盡管目前國內外已建立了一些B 細胞腫瘤細胞系[2-3]，但是迄今未見報道有同時表達 HLA-A*0201 和 IgHV3 家族的人 B 細胞系。本研究中我們建立一株 HLA-A*0201 和IgHV3 都表達的永生化 B 細胞系，并對其相應的生物學特征進行鑒定。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 細胞標本 取 29 例健康志愿者外周血建立永生化細胞系，標本由北大第一醫院楊艷玲教授惠贈。要求供者既往無疾病史和手術史，并簽署了知情同意書。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640 培養基和胎牛血清購自美國 Hyclone 公司；DNA 提取試劑盒購自美國 Axygene bioscience 公司；PCR 試劑盒購自天根生化科技北京有限公司；HLA SSP 位點分型試劑盒購自美國 Pel Freez Dynal 公司；IgHV1 ～ IgHV7家族 PCR 引物由美國 Invitrogen 公司合成；各種CD 分子抗體和 T 細胞受體（TCR）均為美國 BD公司產品；青霉素/鏈霉素雙抗試劑購自北京索萊寶科技有限公司；其他化學試劑為國產分析純；B 淋巴細胞培養體系為在 RPMI 1640 培養基中加入熱滅活的 10% 胎牛血清、5 mmol/L 谷胺酰胺、1.6% Hepes、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素，并用氫氧化鈉調節pH 值在 7.0 ～ 7.2。

1.1.3 主要儀器 TS100 型倒置相差顯微鏡為日本 Nikon 公司產品；Alpha 2200 型凝膠像系統為美國 Innotech 公司產品；PCR Thermal Cycler 熱循環儀為美國 ABI 公司產品；FACScan 流式細胞儀為美國 BD 公司產品；染色體自動圖像分析儀為美國 Applied Immage 公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞建系過程 分別鑒定樣本的 HLA 類型，然后按照文獻描述的方法，以 Epstein-Barr 病毒（EBV）轉染采集的健康人外周血淋巴細胞、鑒定后凍存[4-6]。將 EBV 轉染成功的外周血淋巴細胞復蘇、體外培養 1 周后，用臺盤藍染色，觀察細胞活力并計數細胞濃度。用含 20% 胎牛血清的 1640 全培養基將細胞濃度稀釋為 100、50 和10 個/ml 三個不同濃度的稀釋度。在 96 孔培養板中，每個稀釋度 32 孔，每孔加入各濃度細胞100 μl，定量至 200 μl。放置在 37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。每 3 天換液一次。細胞培養 1 ～2 周后倒置顯微鏡下觀察挑選增殖的克隆，轉移至48 孔培養板中繼續培養，每 3 天半量換液一次。細胞培養 1 ～ 2 周后挑選增殖的克隆，轉移至6 孔培養板中培養。將 96 孔板中增殖的克隆重復有限倍比稀釋法兩次后，依次轉移至 48 孔板、6 孔板、培養瓶中培養。傳代 80 次后細胞增殖良好，提取 DNA 并進行相應的生物學鑒定。

1.2.2 DNA 提取 按照 Axygene bioscience 公司的 AxyPrepTMBlood Genomic DNA miniprep kit試劑盒說明書提取，具體如下：取 250 μl 細胞懸液加入 AP1 Buffer 液 500 μl，振蕩 10 s 后，加入AP2 Buffer 液 100 μl 混勻后振蕩 10 s。室溫下，12 000 × g 離心 10 min，吸取上清。上清在 2 ml 離心管中過 mini prep 柱，6 000 × g 離心 1 min，倒掉濾液。加 700 μl W1A buffer 液過 min prep 柱，室溫靜置 2 min 后，6 000 × g 離心 1 min，棄去濾液。加 500 μl W2 buffer 液過柱，12 000 × g 離心1 min，棄去濾液。將 min prep 柱放在 1.5 ml EP 管上，加 80 ～ 200 μl TE 緩沖液洗柱，靜置 2 min 后，12 000 × g 離心 1 min 后得到 DNA。

1.2.3 PCR 方法檢測 IgHV 家族表達 設計合成 IgHV1-7 個家族的引物序列（5’-3’），如下：VH1/7：CATGGACTGGACCTGGAG；VH2：CACA CTTTGCTCCACGCTC；VH3：GCTGGGTTTTCCT TGTTG；VH4：TGGTGGCAGCTCCCAGAT；VH5：CCCTCCTCCTGGCTGTTC；VH6：CTTCCTCATCT TCCTGCCC。下游引物序列為：JH：ACCTGAGGA GACGGTGACC，以 ZP-1 細胞 DNA 為模板，利用上述引物進行 PCR 擴增。PCR 反應總體系為25 μl：Mix buffer 12.5 μl；DNA 模板 1 μl；引物1 μl；dd H2O 5.5 μl。PCR 反應條件為：94 ℃ 預熱3 min，94 ℃ 40 s；60 ℃ 50 s；72 ℃ 1 min；30 個循環后，72 ℃ 延伸 7 min。將 PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 PCR-SSP 方法檢測 HLA 分型 將提取的 DNA 按照 Pel freez 試劑盒說明書步驟進行，以 PCR-SSP 方法檢測 HLA 低分辨位點和HLA-A*02 高分辨位點的表達。

1.2.5 流式分析細胞表面免疫表型 將 ZP-1 細胞用 PBS 洗滌 2 次，400 × g 離心 5 min 后，棄上清。以 50 μl PBS 重懸細胞后，分別加入 10 μl抗 CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD5、CD25、抗 lambda、抗 kappa、抗 TCRalpha、抗 TCRbeta、避光孵育 15 min 后，加入 200 μl PBS 洗細胞，400 × g 離心 5 min 后，棄上清，PBS 洗細胞2 遍后，加入 200 μl PBS 重懸細胞，上機檢測。

1.2.6 細胞遺傳學分析 將細胞在 37 ℃ 5% CO2孵箱中培養 24 h。終止培養前 2 h 加入秋水仙堿，終濃度 0.1 μg/ml，輕搖勻，放回 37 ℃、5% CO2孵箱中培養。24 h 后，取出培養物，250 × g 離心10 min，棄上清。然后加入預熱的低滲液 0.075 mol/L KCl，混勻后在 37 ℃ 水浴箱中水浴 30 min，在終止低滲前 1 min 加入固定液，混勻后固定 10 min，250 × g 離心 7 min，固定 3 次后，將標本置于4 ℃ 冰箱過夜。

2 結果

2.1 HLA 分型結果

29 例樣本中做 HLA-A 篩查，9 例為HLA-A*0201 陽性細胞。最終建立的永生化細胞系命名為 ZP-1 細胞，其 HLA 檢測結果顯示HLA-A* 低分辨率位點為 HLA-A*01、HLA-A*02；HLA-B* 低分辨率位點為 HLA-B*46、HLA-B*49；HLA-DR 低分辨率位點為HLA-DR*09、HLA-DR*13 （圖 1）。其中 HLA-A*02 高分辨率位點為 HLA-A*0201（圖 2）。

2.2 IgHV 家族表達 PCR 結果

9 例 HLA-A*0201 細胞樣本進行了單克隆有限稀釋法培養，獲得 3 個 B 細胞克隆性細胞系。做 PCR IgHV 7 個家族的分析，其中第 1 和 7 家族放置同一管內。ZP-1 細胞 PCR 擴增結果顯示其僅表達 IgHV3 家族（圖 3）。證實 3 個克隆是IgHV3 家族單克隆表達的細胞系。將其中生長增殖最佳的細胞傳代 80 代，命名為 ZP-1 細胞。

2.3 細胞表型分析結果（圖 4）

外周血淋巴細胞來源的 ZP-1 細胞其細胞表型結果顯示表達 CD4+、CD10dim+、CD19+、CD45+、anti-HLA-DR+、CD38+、anti-Lambda+。說明 ZP-1 細胞是 B 細胞來源的細胞系；CD 分子標志 CD3、CD5、CD8、CD34、CD25 和 TCRαβ、TCRγδ 不表達。

圖 1 ZP-1 細胞表達 HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-B*46、HLA-B*49 和 HLA-DR*09、HLA-DR*13Figure 1 ZP-1 cells express the HLA-A*01, HLA-A*02, HLA-B*46, HLA-B*49 and HLA-DR*09, HLA-DR*13

圖 2 ZP-1 細胞 HLA-A*02 高分辨位點表達 HLA-A*0201Figure 2 The high resolution loci of ZP-1 cells for HLA-A*02 is HLA-A*0201

2.4 染色體核型分析結果

結果顯示 ZP-1 細胞具有正常的核型，具體為46（XX）（圖 5）。

圖 3 ZP-1 細胞表達 IgHV3 家族Figure 3 ZP-1 cells express IgHV3 family

圖 4 ZP-1 細胞表型流式結果顯示為 CD19+、CD4+、CD10dim+、antiHLA-DR+、CD38+、antilambda+、CD45+Figure 4 The flow cytometry assay for ZP-1 phenotype are CD19+, CD4+, CD10dim+, antiHLA-DR+, CD38+, antilambda+and CD45+

圖 5 正常女性核型 46（XX）Figure 5 The normal femal karyotype 46(XX)

3 討論

在體外建立 B 細胞腫瘤細胞系已成為研究 B細胞腫瘤的重要工具。目前，盡管國內外 B 細胞腫瘤系已有 100 多種，但是迄今未見報道有同時表達 HLA-A*0201 和 IgHV3 家族的人 B 細胞系。正常 B 細胞和腫瘤細胞可以根據 B 細胞膜表面的免疫球蛋白重鏈框架區序列同源性分屬于IgHV1 ～ V7家族中的某一個家族。已有研究證實針對框架區序列的抗原表位能夠激發抗原特異的免疫反應，成為未來 B 細胞腫瘤免疫治療的新治療靶點[7-9]。人群中 IgHV3 家族約占 30% ～ 40% 左右，成為 IgHV1 ～ V7 家族中表達頻率最高的家族。本實驗從一名健康女性志愿者身上抽取外周血，分離培養建立細胞系，命名為 ZP-1 細胞。構建的 ZP-1 細胞株 PCR 結果顯示表達 IgHV3 家族，可以用作過繼性免疫治療中的誘導劑，誘發特異性抗 IgHV3 抗原的細胞毒 T 細胞（CTL）產生，將這些 CTL 細胞輸注給淋巴瘤細胞表達 IgHV3抗原的患者，治療淋巴瘤。

已知 HLA 分子在參與抗原呈遞識別、免疫調節遺傳控制、T 細胞限制性識別等過程中起著重要作用[10-11]。其中 HLA-I 類分子在臨床骨髓移植，疫苗體內免疫應答方面起著限制性作用，HLA-I 類分子中[12-14]，HLA-A*0201 在我國人群中分布最廣，占 50% 左右[15]，在病毒和腫瘤抗原呈遞過程中起很重要的作用[16-18]。我們對 ZP-1 細胞株采用試劑盒 PCR-SSP 方法檢測 HLA 表達顯示HLA-A 低分辨位點分別是 HLA-A*01、HLA-A*02；然后對 HLA-A*02 位點進行高分辨，HLA-A*0201 表達陽性。HLA-A*0201 表達陽性的ZP-1 細胞對 HLA 限定性疫苗研制試驗有著重要意義?？勺鳛橐呙缭囼炦^程中的細胞模型和實驗載體。同時，我們對 ZP-1 細胞 HLA-B、HLA-DR 位點也進行了檢測，結果顯示為 HLA-B*46、HLA-B*49 以及 HLA-DR*09、HLA-DR*13。ZP-1的細胞免疫表型特征也做了流式細胞免疫表型分析。分析顯示其 CD3–、TCRαβ–、TCRγδ–、kappa–、CD25–、CD56–、CD8–提示 ZP-1 細胞是非 T、NK 細胞來源的細胞系。CD4+、CD19+、lambda+、HLA-DR+、CD10dim+ 也進一步揭示了 ZP-1 細胞是一個 B 細胞來源的細胞系，且分泌 lambda 游離輕鏈。我們的染色體核型分析結果未發現有染色體易位或者其他異常，顯示為 46（XX），證實 ZP-1細胞是來源于正常女性的細胞系。

在 B 細胞中，表達 HLA-A*0201 和 IgHV3家族的細胞在人群中所占比例較高具有代表意義，因而 ZP-1 細胞有望為相關疫苗研制和篩選新藥提供重要的細胞模型。對 B 細胞疾病的進一步研究具有重要的作用和意義。

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ObjectiveEstablishment of human B cell line expressing specific immunoglobulin variable regions antigen.

MethodsIn the 29 cases of Epstein-Barr virus (EBV) transformed B lymphocytes to establish immortalized lymphoblastoid cell lines, PCR-SSP method detected the expression of HLA-A*0201. The HLA-A*0201(+) monoclonal cell line was obtained by limiting dilution culture, designated as ZP-1. The PCR, flow cytometry and chromosome analysis were used to detect the expression of IgHV family, phenotype CD molecules and chromosome, respectively.

Results Three HLA-A*0201(+) cell clones were aquired by monoclone culture, one of these named ZP-1 cell. IgHV3 family was detected by PCR. The B cell phenotype was identified by flow cytometry. Such as CD19, lambda chain, et al. Karyotype analysis showed that ZP-1 cells have a normal female chromosome structure.

Conclusions A human B cell line expressing specific immunoglobulin variable regions antigen was established. It provided a useful tool to develop the vaccine or molecular target drugs of B cell related diseases.

【Key words】Lymphoma, B-cell; Immunoglobulins; Vaccines

Author Affiliation: The Blood Research Laboratory, the Peking University First Hospital, Beijing 100034, China

Chin Med Biotechnol, 2010, 5(6):410-414

目的建立表達特定免疫球蛋白可變區抗原的人 B 細胞系。方法 在 29 例 EBV 轉化 B 淋巴細胞建立永生化淋巴母細胞系中，PCR-SSP 方法檢測 HLA-A*0201 表達的細胞系，將表達 HLA-A*0201 的細胞系通過有限稀釋培養方法獲得單克隆細胞系 ZP-1。分別用 PCR 方法、流式細胞儀和染色體核型分析檢測細胞 IgHV 家族、細胞表面免疫表型 CD 分子和染色體核型表達。

結果HLA-A*0201(+) 的細胞，經單克隆化培養后獲得3 個細胞克隆，將其中之一命名為 ZP-1。PCR 檢測顯示ZP-1 細胞表達 IgHV3 家族；流式細胞儀檢測顯示 ZP-1細胞表達 CD19、lambda 鏈等 B 細胞免疫表型；核型分析結果顯示，ZP-1 細胞為正常女性染色體結構。

結論成功獲得表達特定免疫球蛋白可變區抗原的人 B細胞系，為研發 B 細胞相關疾病的疫苗和分子靶向藥物提供良好的實驗基礎。

Corresponding Author:ZHU Ping, Email: zhuping@bjmu.edu.cn www.cmbp.net.cn

基金項目：科技部國際科技合作重大項目（2006DFB31430）

作者單位：100034 北京大學第一醫院血液研究室

通訊作者：朱平，Email：zhuping@bjmu.edu.cn

收稿日期：2010-09-29

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.002

Establishment and biological characteristics of human B cell line CZ-1 expressing specific immunoglobulin variable regions antigen

LIU Hui, ZHU Ping

【Abstract】